膠體金標(biāo)記試劑的檢測
膠體金粒子在pH值接近蛋白質(zhì)的pI時(shí),二者容易形成牢固的結(jié)合物。膠體金粒子可以廣泛地與抗免疫球蛋白抗體、蛋白A、鏈霉親合素等結(jié)合。由于結(jié)合的蛋白可與金粒子緩慢地分離,因此,膠體金試劑在使用前應(yīng)該通過洗滌去除游離蛋白。
金標(biāo)記zui初用于電子顯微鏡研究,但亦可用于光學(xué)顯微鏡,得到比酶標(biāo)記方法較高的分辨率,而且,可避免底物的準(zhǔn)備及內(nèi)源性酶活性干擾等問題。金標(biāo)記在光學(xué)顯微鏡水平雖缺乏敏感性,但應(yīng)用光化銀增強(qiáng)顯影方法克服了這一問題。
非擴(kuò)大的金標(biāo)記可直接用于光學(xué)顯微鏡檢測,在明視野下,依據(jù)反應(yīng)強(qiáng)度的不同,標(biāo)記范圍從淡粉色到深紅色,Nomarski不同的干擾與光學(xué)顯微鏡形成對照,使標(biāo)記物呈現(xiàn)深紅色到黑色。使用銀增強(qiáng)方法,金粒子由金屬銀包被形成一種黑褐色標(biāo)記物,通過明視野極易觀測。膠體金標(biāo)記方法可與許多組織化學(xué)染色方法相配合。金標(biāo)記反應(yīng)亦很容易控制,因?yàn)槿旧某尸F(xiàn)過程可在光學(xué)顯微鏡下直接監(jiān)測,并可有控制地繼續(xù)進(jìn)行。
1.需要的溶液和特殊設(shè)備
0.5mol/L的枸櫞酸鈉(pH3.5) 5.6%羥苯醌(避光保存);
0.73%乳酸銀(避光保存);
1%乙酸
標(biāo)準(zhǔn)的固定液。
檢測用的暗室,光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果)。
2.操作步驟
(1)在蒸餾水中短暫地漂洗標(biāo)本片,標(biāo)本片可以在染色后直接檢測或者用銀增強(qiáng)處理后觀察,用Gelvattol或者M(jìn)owiol封片;
(2)銀增強(qiáng)方法,轉(zhuǎn)移樣本到暗室中。檢測劑的準(zhǔn)備:混合2份0.5mol/L枸櫞酸鈉(pH3.5),3份5.6%羥苯醌和12份水。使用前再直接加3份0.73%乳酸銀;
(3)將金標(biāo)記物處理的標(biāo)本片浸泡于此檢測液中,室溫孵育2~3min;
(4)用1%乙酸短暫地漂洗,并在標(biāo)準(zhǔn)攝影固定液中固定數(shù)分鐘;
(5)優(yōu)化:如果需要,進(jìn)行復(fù)染;
(6)樣品用DPX封片。