以下4種方法一般用于組織免疫染色的準備。分別是冷凍組織切片；多聚甲醛固定石蠟包埋組織切片；灌流動物的組織切片；細胞涂片。所有這些過程zui終獲得的標本都需固定到載玻片上，為加抗體做準備。

 

一、組織切片免疫染色過程

    組織切片免疫染色技術(shù)可分為3個步驟：①組織的制備和切片；②樣本與抗體結(jié)合；③檢測。

樣本被固定到載玻片上后，加特異性抗體與其相應的抗原結(jié)合，沒有結(jié)合的抗體則被洗掉；再加標記的相應二抗，與一抗發(fā)生特異性反應；沖洗后，抗原的位置可以通過檢測標記的二抗而得知。

 

二、組織標本的制備

    免疫染色的組織材料主要有兩種來源。首先，研究者可以自己收集、固定標本，這樣所有的步驟都可以優(yōu)化。盡管如此，但大多研究者還是希望實驗的組織材料是在病理室貯存的或在其他貯藏器內(nèi)貯存的材料。這些標本常以石蠟包埋塊貯存，來源于組織化學分析以及抗原分析的有關信息極為重要。但是應該認識到這些樣品的收集存在以下的問題：①固定的時間和條件很難標準化；②固定液、貯存條件及貯存時間不同。在這種情況下，有些抗原、抗體結(jié)合的結(jié)果意義不大，因其對不同的固定不很敏感，對另外一些檢測也許很有意義。

目前貯存收集的樣本常常是速凍組織，這是免疫染色有價值材料的來源。但是也很難標準化，且組織化學信息資源有限。冷凍切片所得的標本可與多數(shù)來源的抗體較好地發(fā)生反應。以下分別介紹制備組織標本的主要方法。這里不涉及如何使用不同型號的切片機和恒冷箱切片機進行組織切片，因其操作方法差異很大。

 

三、結(jié)合

    一旦組織被固定并有良好的透過性，就可以加入抗體。與其他許多免疫化學技術(shù)一樣，可以直接標記一抗，或者通過使用標記的二抗，再與一抗特異結(jié)合進行檢測。一般情況，直接標記的一抗可以形成較低背景的清晰信號，直接檢測的主要缺點是一抗的標記和純化的準備費時，這使得直接檢測用于組織免疫染色更加困難。除特殊情況外，推薦采用商業(yè)來源的各種標記的二級試劑進行間接檢測。

    間接檢測時一些試劑可以與一抗特異性結(jié)合，發(fā)揮橋連作用，這些試劑包括抗免疫球蛋白抗體，蛋白A或蛋白G，或者一抗用生物素、鏈霉親和素標記。間接標記的主要優(yōu)點是一種標記試劑可以用于多種一抗的檢測。間接檢測方法一般可得到較強的信號，但背景較高。因此，必須設置適當?shù)膶φ铡?/div>

方  法	優(yōu)    點	缺    點	推薦應用
熒光染色	高分辨率，可以雙標記	要求特殊顯微鏡，經(jīng)過一定時間褪色，易發(fā)生熒光猝滅	高分辨率研究，可雙標記，酵母菌和蟲體染色用此法
酶	高敏感性，只需普通光學顯微鏡，持久	分辨率低，受內(nèi)源性酶活性干擾，一些底物有毒性，難于雙染色	低分辨率的研究，快速檢測抗原
膠體金	高分辨率，可雙標記，只需光學顯微鏡	尚未廣泛使用，缺乏經(jīng)驗	組織染色較好的替代方法