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美麗線蟲免疫染色的特殊性
閱讀:605 發(fā)布時間:2011-3-24美麗線蟲(caenorhabditis)抗原的免疫定位是一種比較新的方法,其基本原理遵循組織切片染色的原則,但美麗線蟲的角質(zhì)膜透化處理給方法學(xué)帶來更大的困難。通過一系列的強烈固定和透化處理步驟,角質(zhì)膜的問題亦可克服。但由于對這種線蟲免疫組化方面的研究起步較晚,時間相對較短, 目前僅有為數(shù)不多的可靠方法,能使抗體透過角質(zhì)膜。其方法學(xué)尚有待進一步改進和完善。
1.擊破角質(zhì)膜
由于角質(zhì)膜的保護作用使該類線蟲的染色有一定困難。在幼蟲期這一問題尤其突出,特別是在I。1期,此期的蟲膜對透化作用的抗性zui強。通過*固定及凍融可使角質(zhì)膜的二硫化物減少,從而使抗體能夠透過角質(zhì)膜。在某些情況下,也可使用膠原酶處理角質(zhì)膜。但這些方法都是比較強烈的,常常破壞抗原結(jié)構(gòu),尤其是凍融過程中冰晶的形成具有強烈的破壞性。在許多其他系統(tǒng)中,例如,對哺乳動物組織,并不推薦凍融,因為凍融可使組織和細胞受到破壞。在這種線蟲中,反復(fù)凍融的次數(shù)應(yīng)盡可能減少。膠原酶的使用同樣有一些困難,每批膠原酶的作用不相同;每只蟲在發(fā)育的不同階段,其敏感性亦不同。因此,在對這種線蟲進行免疫染色時,應(yīng)注意調(diào)整實驗的條件以適合形成抗原抗體復(fù)合物的所需量。
2.方法概述
實驗方案概括為在多聚甲醛/Bouin固定液中固定,通過凍融進行透化處理;在某些情況下也可通過膠原酶處理,或用還原劑處理以打開角質(zhì)膜,然后加入抗體便可透過角質(zhì)膜。對這種線蟲的免疫染色檢測可以使用熒光染料標記的二級試劑。
下面討論的實驗方案分為兩部分。*部分列出兩種固定方法;第二部分為抗體的加入和檢測步驟,這些對所有蟲體的染色程序都適用。在*部分中介紹Bouin液和多聚甲醛固定方法。如無特殊需要,推薦使用Bouin固定法作為起點。