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石蠟組織切片的制備
閱讀:1158 發(fā)布時(shí)間:2011-3-24當(dāng)尋找適用的方法時(shí),請(qǐng)注意下述資料是10多年經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶。
制備1升Bouin固定液:2g苦味酸溶于500ml去離子水中,濾過,在通風(fēng)櫥中,加入20g多聚甲醛,加熱至60℃,加數(shù)滴lmol/LNaOH使其溶解;冷卻,加500ml 2xPBS。
大多數(shù)的組織學(xué)研究都采用多聚甲醛固定、石蠟包埋的組織標(biāo)本。因此,此類來源的大多數(shù)的組織和器官,對(duì)抗原的定位可直接提供可靠的資料。組織學(xué)家和病理學(xué)家有豐富的組織學(xué)經(jīng)驗(yàn),并且,對(duì)抗原表達(dá)模式的評(píng)價(jià)是很有價(jià)值的。
如果固定和包埋過程粗糙,則許多抗原不能被很好地保存。固定的持續(xù)時(shí)間是一個(gè)很重要的可變因素,因?yàn)檠娱L固定時(shí)間會(huì)降低抗體反應(yīng)能力。在病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室,固定的持續(xù)時(shí)間和其他細(xì)節(jié)也很少規(guī)范化。因?yàn)楣潭ㄒ簩?duì)組織的穿透率在特定溫度下是恒定的(大約室溫下imm/h),所以,不可能將所有樣品用相同的方式固定。因免疫染色的目的不同,固定方法應(yīng)各異。理想的設(shè)計(jì)是研究者能夠?qū)?biāo)本的收集、固定專門化,在研究中優(yōu)化設(shè)計(jì),從而能夠更好地證實(shí)抗原。
避免使用含有汞的固定液。
1.準(zhǔn)備工作
石蠟組織塊可以事先準(zhǔn)備,切片可以在步驟5中完成。許多病理學(xué)或其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)室有大量貯存的研究材料。
2.需要的溶液和特殊設(shè)備
4%多聚甲醛(新鮮配制,見附錄Ⅳ)或Bouin固定液,詳見步驟2;
二甲苯、100%乙醇和95%乙醇;
切片機(jī),石蠟包埋設(shè)備。
3.操作步驟
(1)將組織切成小塊約lcm×lcm×0.4cm。
Methocarn是甲醇:氯仿:冰乙酸按6:3:1的比例配制的混合物。當(dāng)使用Methocarn時(shí),切片的*步必須使用無水乙醇。
(2)將組織塊放入固定液中,如果標(biāo)本制備專為進(jìn)行免疫化學(xué)定位研究,包括直接染色或者對(duì)比染色、復(fù)染,建議使用新鮮配制的4%多聚甲醛。然而,標(biāo)準(zhǔn)的病理學(xué)方法可以有效地使用任何一種廣泛適用的固定液,包括Bouin液或Methocarn。
固定液穿透組織大約每小時(shí)imm??梢杂纱斯烙?jì)判定所需要的固定時(shí)間。
(3)標(biāo)本孵育2h至過夜。
(4)標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋過程和組織切片。
(5)收集4um切片,粘于干凈的載玻片上。
石蠟組織塊在步驟4??少A存,供以后檢測(cè)。石蠟組織塊較穩(wěn)定,可以使用多年。
(6)標(biāo)本片于37℃孵育過夜。
高溫(步驟6)常常在許多組織化學(xué)過程中被采用,但是常會(huì)引起許多抗原表位的缺失,所以應(yīng)盡可能避免。
(7)切片用二甲苯脫蠟,換2次,每次3min。
(8)用系列乙醇水化(100%乙醇,換2次,每次3min;95%乙醇,換2次,每次3min。
(9)用水漂洗。
由于固定、包埋和準(zhǔn)備條件粗糙,石蠟包埋組織切片的染色常要求敏感的檢測(cè)方法和應(yīng)用多步驟放大效應(yīng)技術(shù)。
此時(shí),標(biāo)本可進(jìn)行抗體染色
4.常見的問題
如果使用過氧化物酶或者堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測(cè)方法,在加入抗體前如果需要阻斷內(nèi)源性酶的活性,則標(biāo)本應(yīng)該先阻斷或抑制內(nèi)源性酶的活性。由于阻斷過程也許會(huì)損傷一些抗原,所以不如改用檢測(cè)試劑。
阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,使用甲醇:3%過氧化氫(按4:1的比例配制)溶液孵育標(biāo)本20min。過氧化氫一般以30%的溶液貯存于4℃,可以存放1個(gè)月。有些標(biāo)本如睥或骨髓具有較高過氧化氫酶活性,則采用0.1%鹽酸苯肼/PBS溶液會(huì)取得較好的效果。盡管有些資料建議單純使用3%過氧化氫處理標(biāo)本,但是不應(yīng)該這樣做,因?yàn)閯×业姆磻?yīng)和氣泡的形成可以破壞標(biāo)本。
阻斷內(nèi)源性堿性磷酸酶活性,則用0.1 mm01/L左旋咪唑溶液孵育。此抑制劑不能減少腸組織的堿性磷酸酶活性。因此,堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體不宜用于有內(nèi)源性腸堿性磷酸酶的標(biāo)本染色。