制備1升Bouin固定液：2g苦味酸溶于500ml去離子水中，濾過，在通風(fēng)櫥中，加入20g多聚甲醛，加熱至60℃，加數(shù)滴lmol／LNaOH使其溶解；冷卻，加500ml 2xPBS。

    大多數(shù)的組織學(xué)研究都采用多聚甲醛固定、石蠟包埋的組織標(biāo)本。因此，此類來源的大多數(shù)的組織和器官，對(duì)抗原的定位可直接提供可靠的資料。組織學(xué)家和病理學(xué)家有豐富的組織學(xué)經(jīng)驗(yàn)，并且，對(duì)抗原表達(dá)模式的評(píng)價(jià)是很有價(jià)值的。

    如果固定和包埋過程粗糙，則許多抗原不能被很好地保存。固定的持續(xù)時(shí)間是一個(gè)很重要的可變因素，因?yàn)檠娱L(zhǎng)固定時(shí)間會(huì)降低抗體反應(yīng)能力。在病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，固定的持續(xù)時(shí)間和其他細(xì)節(jié)也很少規(guī)范化。因?yàn)楣潭ㄒ簩?duì)組織的穿透率在特定溫度下是恒定的（大約室溫下imm／h），所以，不可能將所有樣品用相同的方式固定。因免疫染色的目的不同，固定方法應(yīng)各異。理想的設(shè)計(jì)是研究者能夠?qū)?biāo)本的收集、固定專門化，在研究中優(yōu)化設(shè)計(jì)，從而能夠更好地證實(shí)抗原。

    避免使用含有汞的固定液。

    1．準(zhǔn)備工作

    石蠟組織塊可以事先準(zhǔn)備，切片可以在步驟5中完成。許多病理學(xué)或其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)室有大量貯存的研究材料。

    2．需要的溶液和特殊設(shè)備

    4％多聚甲醛（新鮮配制，見附錄Ⅳ）或Bouin固定液，詳見步驟2；

    二甲苯、100％乙醇和95％乙醇；

    切片機(jī)，石蠟包埋設(shè)備。

    3．操作步驟

    （1）將組織切成小塊約lcm×lcm×0．4cm。

    Methocarn是甲醇：氯仿：冰乙酸按6：3：1的比例配制的混合物。當(dāng)使用Methocarn時(shí)，切片的*步必須使用無水乙醇。

    （2）將組織塊放入固定液中，如果標(biāo)本制備專為進(jìn)行免疫化學(xué)定位研究，包括直接染色或者對(duì)比染色、復(fù)染，建議使用新鮮配制的4％多聚甲醛。然而，標(biāo)準(zhǔn)的病理學(xué)方法可以有效地使用任何一種廣泛適用的固定液，包括Bouin液或Methocarn。

    固定液穿透組織大約每小時(shí)imm?？梢杂纱斯烙?jì)判定所需要的固定時(shí)間。

    （3）標(biāo)本孵育2h至過夜。

    （4）標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋過程和組織切片。

    （5）收集4um切片，粘于干凈的載玻片上。

    石蠟組織塊在步驟4常可貯存，供以后檢測(cè)。石蠟組織塊較穩(wěn)定，可以使用多年。

    （6）標(biāo)本片于37℃孵育過夜。

    高溫（步驟6）常常在許多組織化學(xué)過程中被采用，但是常會(huì)引起許多抗原表位的缺失，所以應(yīng)盡可能避免。

    （7）切片用二甲苯脫蠟，換2次，每次3min。

    （8）用系列乙醇水化（100％乙醇，換2次，每次3min；95％乙醇，換2次，每次3min。

    （9）用水漂洗。

    由于固定、包埋和準(zhǔn)備條件粗糙，石蠟包埋組織切片的染色常要求敏感的檢測(cè)方法和應(yīng)用多步驟放大效應(yīng)技術(shù)。

    此時(shí)，標(biāo)本可進(jìn)行抗體染色

    4．常見的問題

    如果使用過氧化物酶或者堿性磷酸酶標(biāo)記的檢測(cè)方法，在加入抗體前如果需要阻斷內(nèi)源性酶的活性，則標(biāo)本應(yīng)該先阻斷或抑制內(nèi)源性酶的活性。由于阻斷過程也許會(huì)損傷一些抗原，所以不如改用檢測(cè)試劑。  

    阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，使用甲醇：3％過氧化氫（按4：1的比例配制）溶液孵育標(biāo)本20min。過氧化氫一般以30％的溶液貯存于4℃，可以存放1個(gè)月。有些標(biāo)本如睥或骨髓具有較高過氧化氫酶活性，則采用0．1％鹽酸苯肼／PBS溶液會(huì)取得較好的效果。盡管有些資料建議單純使用3％過氧化氫處理標(biāo)本，但是不應(yīng)該這樣做，因?yàn)閯×业姆磻?yīng)和氣泡的形成可以破壞標(biāo)本。

    阻斷內(nèi)源性堿性磷酸酶活性，則用0．1 mm01／L左旋咪唑溶液孵育。此抑制劑不能減少腸組織的堿性磷酸酶活性。因此，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體不宜用于有內(nèi)源性腸堿性磷酸酶的標(biāo)本染色。