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技術文章

抗體與組織切片的結合

閱讀:874          發(fā)布時間:2011-3-24

因為抗原在細胞染色時需先固定,所以,抗體與抗原的結合比在溶液中結合需要更長的時間。孵育的時間可以根據(jù)實驗設計進行相應調整,但是產生有效結合的時間一般須超過30min。通過增加二抗?jié)舛瓤梢钥s短孵育時間。通常一些折衷辦法可使二者兼頤。產生強烈的信號往往伴有高背景的問題。低濃度試劑產生的背景雖較低,但信號的強度也相應較弱。一般推薦選擇相對較短的時間進行二抗的孵育(30~60min),并應對標記二抗進行滴度測定,使其產生較低背景并形成可接受的信號強度??傊贵w應該用含高濃度非特異性蛋白的緩沖液稀釋。一般使用牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)和脫脂奶粉,或者與標記抗體相同種屬的正常血清。

    1.對照
    特異性染色反應應與對照進行比較。地評價一種染色模式,應該比較來自相同種屬的兩種抗體。對多克隆抗體來說,的對照是制備特異性抗體的同一動物的免疫前采集的血清,但是,在多數(shù)情況下,相同種屬動物的非免疫血清也可以采用。對單克隆抗體而言,對照必需是和特異性抗體的來源相同,即細胞培養(yǎng)上清與上清對比,小鼠腹水與腹水對比,或者純化抗體與純化抗體相對應。如果可能,對照抗體應該是特異性抗體的同類或亞類。來自親代的骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清是不適宜的對照,因其不含抗體。但來自美國典型培養(yǎng)收藏中心(theAmericantypeculturecollection,ATCC)的適當對照雜交瘤細胞系是有效的。此外,如果使用間接測定法,二級試劑亦應經過檢測。當使用酶標檢測法時,應該做未加任何抗體的酶反應對照,以證實某些內源性酶反應的存在與定位。
    2.準備
    對抗體的結合和觀察zui重要的準備工作是對一抗和二抗進行效價的測定。調整加入的一抗和二抗的用量,使之能得到有效強度的信號,而非特異染色較低。一般通過系列稀釋各種抗體來得到這種效果(通常用含蛋白的緩沖液如3%BSA/PBS),并在靶細胞株同時進行實驗觀察。1:3稀釋可以很快得出一個合理的結果。對各種一抗的準備,效價滴定試驗應該重復進行。而對二抗效價滴定后,就可以作為該抗體的使用標準。
    3.需要的溶液和試劑
    一抗、二抗(多數(shù)為商品來源)、PBS和3%/BSA/PBS。
    4.操作步驟
    (1)將組織切片或細胞涂片置于濕盒中。
    (2)加入一抗,所有的稀釋必須用含蛋白的溶液。例如,含3%BSA的PBS。單抗一般是雜交瘤細胞培養(yǎng)上清(特異性抗體濃度一般用20~50ul/ml)。小鼠腹水,純化的單抗和多抗,粗制的多抗血清應該在特異性抗體濃度為0.1~long/m1稀釋范圍內檢測。如果特異抗體濃度是未知的,則將初始材料做1:10,1:100,1:1000,1:10 000稀釋。
    (3)將標本片置濕盒中,室溫孵育至少30min。對某些抗原抗體反應,延長孵育時間至24h,可以增加其敏感性。
    (4)用PBS洗滌,換液3次,每次>5min。此緩沖液可以補加1%TritonX-100或NP-40,有助于解決背景問題。
    (5)加入標記的二抗。二抗必須用含有蛋白的溶液如3%/BSA/PBS或1%免疫球蛋白/PBS(來自檢測試劑的相同種屬)進行稀釋。常用的二級試劑包括酶或膠體金標記的抗免疫球蛋白抗體、蛋白A和蛋白G。
    酶標試劑如果使用商品,檢測時二抗的稀釋范圍在1:50~1:1000。堿性磷酸酶標記的試劑應該用Tris緩沖液稀釋,不可用PBS。
    金標試劑用PBS洗滌金溶膠顆粒。用含1%明膠的PBS稀釋后加至標本上。
    (6)將加標記二抗的標本片放于濕盒中,在室溫至少孵育20min。對于金標試劑,應定期在顯微鏡下觀察直至獲得滿意信號。
    (7)更換PBS,漂洗3次,每次5min。
    至此,標本片即可用于檢測。
    5.常見的問題
    如果發(fā)現(xiàn)背景較深,常為非特異性結合所致,可以用含蛋白液體預先孵育標本而加以抑制。
    一般使用的蛋白溶液是3%BSA,10%FBS(胎牛血清,因只含有低濃度的IgG),10%干奶粉或者來自與檢測試劑相同種屬的純抗體(1%)。阻斷蛋白可以加在各種抗體的準備階段,也可以在加入抗體前預先孵育標本。

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