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技術(shù)文章

雜交瘤技術(shù)的基本原理

閱讀:771          發(fā)布時間:2011-5-30

雜交瘤技術(shù)的基本原理

點(diǎn)擊次數(shù):7 發(fā)布時間:2010-12-29 10:04:28

雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細(xì)胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠B細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長(選擇原理見后),小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖,即所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下,只有B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交才具有持續(xù)增殖的能力,形成同時具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞克隆。其原理從下列3個主要步驟闡明。

(一)細(xì)胞的選擇與融合
建立雜交瘤技術(shù)的目的是制備對抗原特異的單克隆抗體,所以融合細(xì)胞一方必須選擇經(jīng)過抗原免疫的B細(xì)胞,通常來源于免疫動物的脾細(xì)胞。脾是B細(xì)胞聚集的重要場所,無論以何種免疫方式刺激,脾內(nèi)皆會出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。融合細(xì)胞的另一方則是為了保持細(xì)胞融合后細(xì)胞的不斷增殖,只有腫瘤細(xì)胞才具備這種特性。·選擇同一體系的細(xì)胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是B細(xì)胞系惡性腫瘤,所以是理想的脾細(xì)胞融合伴侶。
使用細(xì)胞融合劑造成細(xì)胞膜一定程度的損傷,使細(xì)胞易于相互粘連而融合在一起。*的融合效果應(yīng)是zui低程度的細(xì)胞損傷而又產(chǎn)生zui高頻率的融合。聚乙二醇(PEG1 000~2 000)是目前zui常用的細(xì)胞融合劑,一般應(yīng)用濃度為40%(W/V)。

(二)選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用
細(xì)胞融合是一個隨機(jī)的物理學(xué)過程。在小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合細(xì)胞懸液中,經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)。如融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體形式等。正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中僅存活5~7d,無需特別篩選;細(xì)胞的多聚體形式也容易死去;而未融合的瘤細(xì)胞則需進(jìn)行特別的篩選去除。
細(xì)胞DNA合成一般有兩條途徑。主要途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸,進(jìn)而合成DNA,葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下,經(jīng)次黃嘌吟磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有3種關(guān)鍵成分:次黃嘌呤(hypoxanthine,H)、甲氨蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T),所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。甲氨蝶呤是葉酸的拮抗劑,可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA,而融合所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT-細(xì)胞株,所以不能在該培養(yǎng)基中生長。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能,可在HAT培養(yǎng)基中長期存活與繁殖。

(三)有限稀釋與抗原特異性選擇
在動物免疫中,應(yīng)選用高純度抗原。一種抗原往往有多個決定簇,一個動物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答實(shí)質(zhì)是眾多B細(xì)胞群的抗體分泌,而針對目標(biāo)抗原表位的B細(xì)胞只占極少部分。由于細(xì)胞融合是一個隨機(jī)的過程,在已經(jīng)融合的細(xì)胞中有相當(dāng)比例的無關(guān)細(xì)胞的融合體,需經(jīng)篩選去除。篩選過程一般分為兩步進(jìn)行:一是融合細(xì)胞的抗體篩選,二是在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的特異性抗體篩選。將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋,使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個細(xì)胞之間(30%的孔為0才能保證每個孔中是單個細(xì)胞),培養(yǎng)后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞;這一過程常被習(xí)慣地稱作克隆化。將這些陽性細(xì)胞再進(jìn)行克隆化,應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株,增殖后進(jìn)行凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)。

 

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