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染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChIP）
閱讀：955 發(fā)布時間：2011-6-15染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChIP）
點擊次數(shù)：359 發(fā)布時間：2009-9-22
ChIP是目前確定與特定蛋白結合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結合的蛋白質(zhì)的方法（圖2—8），也可用于分析與轉錄、有絲分裂或DNA損傷相關的發(fā)生改變的組蛋白修飾。ChIP技術和芯片技術的結合有利于確定全基因組范圍內(nèi)染色體蛋白的分布模式以及組蛋白修飾情況。該技術主要應用于：①組蛋白修飾研究；②轉錄調(diào)控分析；③藥物開發(fā)研究；④有絲分裂研究；⑤DNA損失與凋亡分析。ChIP是深入分析癌癥、心血管疾病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具。
1．DNA剪切條件的優(yōu)化
建立打斷交聯(lián)的DNA長度為200—1 000bp的實驗條件。改變超聲時電壓設置，確保操作時，樣品一直放在冰上，因為超聲產(chǎn)生的熱量會使DNA變性，通過電泳檢測恢復交聯(lián)后的超聲DNA片段。
2．實驗步驟
可采用Upstate公司的Chromatinlmmunoprecipitation（ChIPs）AssayKit進行操作。注意：步驟（3）～（7）應該置于冰浴中操作。
（1）處理10C1TI培養(yǎng)皿上1X10‘細胞，確保目的基因處于轉錄激活狀態(tài)，同樣處理另一個10cm培養(yǎng)皿用于細胞計數(shù)。
（2）將組蛋白與DNA相互交聯(lián)，加入終濃度為1％甲醛到培養(yǎng)基上，37℃孵育10min。
（3）盡可能的吸去培養(yǎng)液，用含有蛋白酶抑制劑的冷PBS洗兩次。
（4）將細胞刮人錐形管中。
（5）4℃，2 000r／min離心4min。將SDS裂解液放置室溫，使SDS溶解，并加入蛋白酶抑制劑。
（6）將細胞沉淀加入200／llSDS裂解液，冰上孵育10min（200／ul SDS裂解液是對于1X106細胞，如果有更多的細胞，要相應增加SDS裂解液的用量）。
（7）將DNA用超聲打斷，DNA片段長度為200—1 000bp，應在冰浴中操作，同通過優(yōu)化超聲的條件，使DNA片段長度保持在200—1 000bp之間。
（8）加人8u1 5mol／LNaCl，65℃，4h，解交聯(lián)。
（9）通過酚—氯仿提取DNA，并用含有溴化乙啶的2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察超聲打斷DNA的效率。
3．染色質(zhì)免疫沉淀分析
如果超聲條件通過上述實驗得到優(yōu)化，可以在完成上述（1）一（7）步后，進行下面的實驗。對于陰性對照，可以采用非抗體免疫沉淀對照，另外也要采用非激活的樣品作為PCR部分的對照。
（1）將所得樣品4C，13 000 r／rain離心10 min，加入200／11超聲過的細胞上清液到2ml的離心管中，棄掉沉淀。
（2）將超聲過的細胞上清液用10倍的ChIP稀釋緩沖液稀釋。
（3）為了減少非特異性背景，在2ml的細胞上清液中加入80ul魚精DNA／50％蛋白A瓊脂糖混合物，在4~C震蕩30min，增加孵育時間，可以進一步減少非特異性結合。
（4）通過短暫離心，沉淀瓊脂糖，并收集上清液部分。
（5）加入免疫沉淀的抗體到2ml的上清液部分，在4~C震蕩孵育過夜。對于陰性對照，在上清液中加入60ul魚精DNA／50％蛋白A瓊脂糖混合物，4~C震蕩1h，繼續(xù)上述（7）步驟。
（6）加入60ul魚精DNA／50％蛋白A瓊脂糖混合物，4~C震蕩1h，以結合抗體／組蛋白復合物。
（7）輕微離心沉淀瓊脂糖（700—1 000r／min，4~C，1min），棄掉含有未結合的非特異性DNA，用下面的液體1m1在翻轉板上依次洗蛋白A瓊脂糖／抗體／組蛋白復合物3～5rain。
經(jīng)過上述處理后的樣品為蛋白A瓊脂糖／抗體／組蛋白復合物，可以用于免疫共沉淀／免疫印跡或PCR分析。
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