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放射受體測(cè)定法測(cè)定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFβ

閱讀:493          發(fā)布時(shí)間:2012-7-28

1.培養(yǎng)上清中TGF-β的激活 測(cè)定前必須使無(wú)血清培養(yǎng)上清中TGF-β激活。激活有熱激活和酸激活兩種方法,熱激活法是通過(guò)將標(biāo)本加熱至80℃5min而激活。酸激活法的步驟如下:
①在200uL無(wú)血清培養(yǎng)上清中加6mol/LHCl 1.5ul,使pH≤3.0,22℃孵育30rain;
②用30ul中緩沖液中和,調(diào)至pH7.0~7.4。若pH值不在此范圍,可加少量1:10稀釋的6mol/LHCl或中和緩沖液調(diào)整(中和緩沖液為6mol/LNaOH和1mol/LHEPES等量混合而成);
③用于胸腺細(xì)胞增殖法測(cè)定前,標(biāo)本用RPMI-1640稀釋4倍。

2.在24孔培養(yǎng)板中加A549細(xì)胞1.7X105/孔,在*DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)18~24h,以形成A549細(xì)胞單層,用結(jié)合緩沖液(含0.1%BSA的磷酸鹽緩沖液)洗滌1次。

3.在培養(yǎng)板的前四排中,用結(jié)合緩沖液對(duì)重組或純化TGF-p進(jìn)行系列稀釋?zhuān)瑵舛确秶鸀?—1 000pmol/L,每孔200gL,用于繪制TGF-p的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn);后兩排中,加系列稀釋的酸激活待測(cè)上清,200uL/孔。

4.將培養(yǎng)板置于22℃振蕩2h,用冷結(jié)合緩沖液洗3次,每孔加200/uL 50pmol/L125I-TGF-β,22℃孵育2h。

5.同上洗2次后,加600~L解離緩沖液,22℃作用20min,使細(xì)胞解離。解離緩沖液的配方為:20mmol/LHEPES、2%TritonX-100和10%甘油。

6.從每孔取500uL,用r計(jì)數(shù)儀測(cè)定放射活性。

7.通過(guò)測(cè)定外標(biāo)記TGF-β過(guò)量時(shí)(10nmol/L)的細(xì)胞放射活性,估計(jì)非

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