熒光強(qiáng)度（即發(fā)射熒光的光量子數(shù)）與激發(fā)光（吸收的光量子數(shù)）的強(qiáng)度有關(guān)，激發(fā)光越強(qiáng)，熒光也越強(qiáng)。熒光素可以發(fā)射紅、橙紅、黃、綠及藍(lán)色等熒光。光的強(qiáng)弱也與熒光素溶液的pH值、濃度以及染色時間和溫度等條件有關(guān)。

 

    熒光素的種類很多，但用于標(biāo)記抗體的熒光素不同于一般熒光色素，它必須具備以下條件。

    ①應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基團(tuán)，結(jié)合后不易離解其降解，而未結(jié)合的色素及產(chǎn)物容易排除。

    ②熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光效率下降不多。

    ③結(jié)合抗體蛋白后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響，用于活體內(nèi)標(biāo)記結(jié)合物應(yīng)無毒性，附加抗原性小。

    ④與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法簡便而快速，結(jié)合物在一般條件下穩(wěn)定。

    ⑤熒光素容易溶解，溶解后不會和其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

    ⑥熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。

 

    用于標(biāo)記抗體和蛋白質(zhì)的熒光色素到目前為止有幾十種，下面舉幾種傳統(tǒng)的、較為常用的熒光素。

 

    1．異硫氰酸熒光黃

異硫氰酸熒光黃（fluoreseicnisothiocyanate，F(xiàn)ITC）純品為黃色粉末，有兩種異構(gòu)體，易溶于水和乙醇等溶劑，在溶解狀態(tài)下呈黃綠色熒光。性質(zhì)穩(wěn)定，低溫干燥下可保存多年，室溫下也可保存2年以上。FITC分子質(zhì)量為390Da，zui大吸收光譜為490～495nm，zui大發(fā)射光譜為520—530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，其中異構(gòu)體I型熒光效率更高，與蛋白質(zhì)結(jié)合更穩(wěn)定。

 

    在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，結(jié)合成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個IgG分子上zui多能標(biāo)記15～20個FITC分子。

 

    2．四甲基異硫氰酸羅丹明

    四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）是一種紫紅色粉末，較穩(wěn)定，是羅丹明（Rhodamine）的衍生物，易溶于水。zui大吸收光譜為550nm，zui大發(fā)射光譜為620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)射的黃綠色熒光對比鮮明，經(jīng)常用于雙標(biāo)記染色，使用較多。

 

    3．四乙基羅丹明

    四乙基羅丹明（tetraethyl rhodamine B200，RB200）是褐紅色粉末狀，溶于乙醇和丙酮，不溶于水，zui大吸收光譜570nm，zui大發(fā)射光譜596～600nm，呈橙紅色熒光。因為RB200比較價廉，廣泛用于免疫熒光組化染色和雙標(biāo)記示蹤或染色，RB200不能直接和蛋白質(zhì)結(jié)合，要先經(jīng)五氯化磷（PCIs）作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯（SOzCl），在堿性條件下易與賴氨酸‘氨基反應(yīng)而結(jié)合在蛋白分子上。其分子質(zhì)量為580Da。