用途
本試劑盒為體外測定試劑盒，用酶聯(lián)免疫法定量測定濾紙片上干燥血標(biāo)本中的促甲狀腺素（hTSH），作為新生兒先天性甲狀腺機(jī)能減退癥（簡稱“甲低”）的篩查。
前言
先天性“甲低”是以外周血甲狀腺激素（T3和T4）水平降低為特征的新生兒內(nèi)分泌障礙。世界范圍內(nèi)先天性“甲低”的平均發(fā)病率為1：4，000。此疾病特 點(diǎn)是外周血中甲狀腺激素低于正常水平，而促甲狀腺素高于正常水平。人的促甲狀腺素是由腦垂體前葉合成分泌的。他調(diào)節(jié)和刺激甲狀腺產(chǎn)生甲狀腺激素。甲狀腺激 素缺乏刺激hTSH分泌，存在負(fù)反饋。hTSH水平也受下丘腦分泌的促甲狀腺素釋放激素的影響。因此，新生兒外周血促甲狀腺素濃度提高，可作為篩查判斷先 天性“甲低”的根據(jù)。
新生兒出生前后時(shí)期和出生后幾個(gè)月內(nèi)甲狀腺激素的不足將妨礙其大腦的正常發(fā)育，其zui終結(jié)果是導(dǎo)致不可修復(fù)的大腦功能障礙和骨骼神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙。早期篩查出新生兒先天性“甲低”，用甲狀腺激素的替代治療可防止大腦的發(fā)育不良。
原理
1．新生兒促甲狀腺激素酶聯(lián)免疫測定法（Neonatal hTSH EIA）是一種固相雙位點(diǎn)酶免疫測定法，濾紙片上干燥血標(biāo)本洗提出hTSH，同時(shí)與包被在酶標(biāo)板上抗hTSH的單克隆分子和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗hTSH亞單位的第二抗體結(jié)合。
2．過剩的酶結(jié)合物和未結(jié)合的hTSH被洗滌去掉，加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物溶液進(jìn)行酶反應(yīng)。
3．加入1N硫酸（H2SO4）溶液終止酶反應(yīng)，用酶標(biāo)讀數(shù)儀在450nm下測定吸光度值。
試劑盒組成
試劑盒貯存在+2—+8℃。
不要使用過期試劑。
試劑盒使用前，所有試劑及酶標(biāo)板放置+18—+25℃平衡30分鐘。
TMB底物是光敏感性的，應(yīng)避免光照。
所有試劑組份一旦開啟，密封袋或蓋子緊緊密封。
1 抗-hTSH包被的反應(yīng)板 10塊（12×8孔）
2 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗-hTSH酶結(jié)合物（濃縮100X） 2.5ml
3 酶結(jié)合物稀釋液 250ml
4a TMB顯色劑（25X） 9.5ml
4b 底物緩沖液 250ml
5 洗滌液（濃縮10X） 220ml
6 hTSH標(biāo)準(zhǔn)品 1張5套，每套6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，用錫箔袋包裝。
每批標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值是不相同的，每套試劑盒內(nèi)都有確切的數(shù)值。
7 hTSH質(zhì)控 C1-C2 1張5套，含2個(gè)質(zhì)控，用錫箔袋包裝。
每批質(zhì)控的數(shù)值是不相同的，每套試劑盒內(nèi)都有確切的數(shù)值。
8 終止液 0.45M 硫酸
酶標(biāo)反應(yīng)板的塑料粘膠貼 10張
質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)品的TSH數(shù)值表 1張
試劑的準(zhǔn)備
表1 試劑的準(zhǔn)備
試劑 準(zhǔn)備 開啟或稀釋后的穩(wěn)定性（+2—+8℃）
1 抗-hTSH包被的反應(yīng)板 直接使用 2個(gè)月
2 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗-hTSH酶結(jié)合物（濃縮） 臨用前，用酶結(jié)合物稀釋液按1：100（1+99）稀釋配制。（見表2） 5個(gè)月
廢棄未用完的酶結(jié)合物溶液
3 酶結(jié)合物稀釋液 供配制酶結(jié)合物溶液用 10個(gè)月
4 底物溶液 臨用前，用底物緩沖液（4b）按1：25（1+24）將TMB顯色劑（4a）稀釋成底物溶液。 廢棄未用完的底物溶液
4a TMB顯色劑 直接供配制底物溶液用 6個(gè)月
4b 底物緩沖液 直接供配制底物溶液用 6個(gè)月
5 洗滌液（濃縮） 用蒸餾水按1：10（1+9）稀釋 6個(gè)月
廢棄有渾濁的洗滌液
6 hTSH標(biāo)準(zhǔn)品 直接使用 3個(gè)月
7 hTSH質(zhì)控
8 終止液 直接使用
直接使用 3個(gè)月
6個(gè)月

表2酶結(jié)合物和底物溶液的準(zhǔn)備配制
酶標(biāo)板數(shù)（塊） 酶結(jié)合物（2）
（ml） 酶結(jié)合物稀釋液（3）（ml） TMB-顯色劑（4a）（ml） 底物緩沖液（4b）（ml）
1 0.24 24 1 24
2 0.42 42 2 48
3 0.62 62 3 72
4 0.82 82 4 96
5 1.00 100 5 120
6 1.20 120 6 144
7 1.38 138 7 168
8 1.58 158 8 192
9 1.76 176 9 216
10 2.00 200 10 240

試劑盒中未提供的所需器材
蒸餾水；量筒；試劑瓶；加樣槍；吸水紙；計(jì)時(shí)器；橡膠手套
—酶標(biāo)讀數(shù)儀 如芬蘭Labsystems Multiskan
—板的振蕩器 如芬蘭Labsystems iEMS Incubator/Shaker
—洗板機(jī) 如芬蘭Labsystems Multiwash
—8-道加液器（50—300μl）
—（3mm）打孔器
標(biāo)本的收集和處理
嬰兒出生后3—5天，用濾紙從嬰兒的足跟取一滴血液，獲得帶血點(diǎn)（直徑0.8cm）的濾紙片，并確信濾紙片被血樣*浸透，帶血樣的濾紙片至少晾干2小時(shí)，帶血樣的干燥濾紙片（密封）在+4--+8℃至少可貯存4個(gè)月時(shí)間。
濾紙片標(biāo)本的收集一定是單一的一滴血液，否則會(huì)造成假陽性結(jié)果。這一滴血在濾紙片上擴(kuò)展的面積要足夠大，保證血液從濾紙的上面均勻浸透到下面，浸透不* 會(huì)造成測定的TSH量偏低。采血點(diǎn)應(yīng)稍微靠近足跟的左表面皮膚，抹掉*滴血，用隨后形成的血滴。為提高嬰兒足跟針刺點(diǎn)血流，嬰兒足跟可用熱的（約 42℃）濕毛巾敷3分鐘。不要過分?jǐn)D壓足部，否則會(huì)導(dǎo)致溶血或組織液的稀釋。一滴血形成后，用濾紙片輕輕地接觸血滴，但不要向足跟擠壓，從濾紙背面觀察血 滴透過濾紙。
一般一個(gè)嬰兒要收集三個(gè)血點(diǎn)（三滴血）的濾紙標(biāo)本，血樣點(diǎn)應(yīng)避免污染。置濾紙于水平位置，室溫空氣干燥2至6小時(shí)。注意不要加熱，不要堆積，不要接觸其他 物品表面。將每個(gè)帶血標(biāo)本的濾紙片置于一個(gè)信封中，并郵寄到新生兒篩查中心實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本應(yīng)放置+4--+8℃防濕保存，并及時(shí)篩查。
標(biāo)本收集卡應(yīng)注明以下內(nèi)容：醫(yī)院名稱，編號，嬰兒姓名，出生 年 月 日，住院號，家庭地址，和采血日期。
警告—有潛在生物危險(xiǎn)的材料
標(biāo)準(zhǔn)品，對照雖然已經(jīng)滅活，但不能認(rèn)為無傳染性，應(yīng)認(rèn)為有潛在的傳染可能。標(biāo)本等的處理按生物安全二級水平處理。詳見美國疾病控制中心國立健康研究所的“微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全”手冊。（1984）
操作步驟
操作步驟簡圖
*步 用打孔器在濾紙上打下3mm直徑的標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控和標(biāo)本，并依次放置到包被板孔內(nèi)。
第二步 用酶標(biāo)記抗體稀釋液將酶標(biāo)記抗體按1：100倍稀釋，每孔加入200μl。
室溫振動(dòng)（650rpm）孵育2小時(shí)
或室溫振動(dòng)（650rpm）15分鐘后，+4℃不振動(dòng)過夜。
第三步 去掉標(biāo)本的濾紙片，洗滌液洗滌4次，每次加入300ul。
第四步 加入200μl的底物溶液
室溫避光孵育15分鐘
第五步 加入100μl1N終止液
在波長450nm下測定吸光度值。

檢測前，把所有的試劑和酶標(biāo)反應(yīng)板放置室溫+20--+25℃預(yù)熱30分鐘。
1.用打孔器在濾紙上打下3mm直徑的標(biāo)準(zhǔn)品（雙孔），質(zhì)控（雙孔）和標(biāo)本（每孔1片），并依次放置到抗-hTSH包被的酶標(biāo)板孔內(nèi)。
注意：圍繞血樣點(diǎn)中央對稱地打孔。
2.用酶標(biāo)抗體稀釋液將酶標(biāo)抗體按1：100倍稀釋，每孔加入200μl酶結(jié)合物溶液。
3.孵育
A：室溫（不超過+30℃）振動(dòng)（650rpm）孵育2小時(shí)。（貼上粘紙）
B：室溫振動(dòng)15分鐘后，+4℃不振動(dòng)過夜。（貼上粘紙）
注意：當(dāng)室溫>+30℃時(shí)，應(yīng)選擇過程B。
4.倒去溶液和吸去濾紙片。
5.洗滌
——手工洗滌
每孔加入300μl的洗滌液（試劑5）；
倒去，拍盡液體；
重復(fù)操作4次；
4次洗滌后，輕輕倒拍幾次酶標(biāo)板，倒放在紙巾上一會(huì)兒，吸盡殘液。
——機(jī)器洗滌
洗滌液每孔400μl，重復(fù)洗滌4次。
6.每孔加入200μl的底物溶液（試劑4a＋4b）。
7.室溫 （不超過+30℃）避光孵育30分鐘。（若室溫高于+30℃，則避光孵育15分鐘。）
8.每孔加入100μl1N終止液。
9.在450nm波長下測定各孔的吸光度值。
結(jié)果
結(jié)果的計(jì)算：
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為吸光度，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取質(zhì)控和標(biāo)本的濃度。
質(zhì)量控制值
每批試劑盒的每套試劑盒內(nèi)都要一張單獨(dú)紙片，給出質(zhì)控的期望值，只有質(zhì)控測定值在期望值范圍內(nèi)，結(jié)果才能被接受。
期望值和結(jié)果說明
對于正常的和假定的陽性之間的區(qū)別，是根據(jù)一個(gè)預(yù)定的臨界值。臨界值是根據(jù)給定的正常人口hTSH值的參考范圍，憑經(jīng)驗(yàn)設(shè)定的，高于或接近臨界值的標(biāo)本建議復(fù)試。
性能特點(diǎn)
敏感性 zui小濃度為0.9mIU/L
性
批內(nèi)分析
批內(nèi)分析不度
批間分析
批間分析不度
其他腦垂體激素和人絨毛膜促性腺激素干擾實(shí)驗(yàn)
LH FSH HCG 干擾實(shí)驗(yàn)檢測 在含10 mIU/LTSH血清中加入一定數(shù)量的每種激素。
膽紅素干擾實(shí)驗(yàn)
在濃度為0.05-10g/l,無干擾現(xiàn)象。
準(zhǔn)確性
用CDC質(zhì)控標(biāo)本檢測
臨床評估
labsystems公司的臨床評估分別在兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室。在上海新華醫(yī)院隨機(jī)抽查 10780名新生兒進(jìn)行篩查。樣品從剛剛出生三天的小孩采集。正常健康的嬰兒和甲低陽性的嬰兒濃度分布模式圖如下：
10780份新生兒樣品檢測分布圖，預(yù)定的臨界值設(shè)置為10 mIU/L。此預(yù)定值重測率僅為0.41%。
常見錯(cuò)誤及糾正
低吸收值并且標(biāo)準(zhǔn)曲線很
原因 糾正
1試劑變質(zhì)
*由于污染
*由于儲(chǔ)存不當(dāng) 1當(dāng)需要從一個(gè)試劑瓶中反復(fù)移液使用無菌操作技術(shù)
2根據(jù)說明書所述儲(chǔ)存試劑
2試劑沒有預(yù)熱到室溫 用溫度計(jì)檢查溫度
3反應(yīng)時(shí)間過短 根據(jù)說明書所述進(jìn)行保溫
4讀數(shù)儀波長設(shè)置不正確 讀數(shù)波長應(yīng)為450nm
5讀數(shù)儀被設(shè)置成減去空白 重新設(shè)置讀數(shù)儀

高本底
原因 糾正
1由于吸液不充分引起的洗板不充分 1調(diào)節(jié)清洗頭
2檢查清洗頭是否被纖維堵塞
2保溫時(shí)間過長 根據(jù)說明書所述進(jìn)行保溫
3保溫溫度過高 使用室溫振蕩15分鐘,4℃過夜的方式,底物保溫使用15分鐘.

低精密性
原因 糾正
只有標(biāo)準(zhǔn)曲線不好
標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控由于不恰當(dāng)?shù)膬?chǔ)存而變質(zhì) 避免過度陽光和潮濕,將標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控同干燥劑密封在錫箔袋中,干燥劑應(yīng)是藍(lán)色的.
整板不好
1移液設(shè)備未正確校正 檢查與校正移液器
2由于洗頭的污染而導(dǎo)致不正確的洗板 經(jīng)常清潔清洗頭
3洗板后停留時(shí)間過長,板已干燥 根據(jù)說明書操作
只有病人樣品不好
樣品中血液的不平均分配 如果可能,應(yīng)使用被血液*浸透的樣品

操作注意事項(xiàng)
1.仔細(xì)閱讀試劑盒使用說明書。
2.開始檢測前，把試劑盒內(nèi)所有的試劑及酶標(biāo)板放置+20--+25℃平衡30分鐘。
3.不要使用超過有效期的試劑，不要互用不同批號的試劑，因?yàn)槊颗栐噭┑臉?biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控值有可能不同，注意標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控的單位，分清是血清還是全血。
4.建議每塊板都使用標(biāo)準(zhǔn)品和對照。
5.檢測一旦開始，隨后的步驟應(yīng)連續(xù)地進(jìn)行下去，不要中斷。
6.嚴(yán)格操作，方能獲得理想的檢測結(jié)果。應(yīng)準(zhǔn)確地使用加液器，不要使加液頭子接觸孔壁，避免孔間污染；配制底物溶液等時(shí)，所用的器具必須是潔凈的，仔細(xì)地洗板是很重要的。
7.孵育時(shí)間的輕微變化是許可的,2小時(shí)±10分鐘，20分鐘±5分鐘。
8.TMB顯色劑必須在臨用前配制，TMB顯色劑是溶解在二甲基亞砜中的，二甲基亞砜對眼睛和皮膚有刺激，萬一接觸眼睛應(yīng)立即用清水沖洗，然后 去醫(yī)院治療；接觸皮膚后應(yīng)立即用大量清水沖洗；操作應(yīng)帶手套；氧化劑，金屬離子和肥皂殘留物均能干擾TMB的反應(yīng)。TMB的熔點(diǎn)是18℃，低于此溫度，易 結(jié)晶，使用前應(yīng)放置+18--+25℃平衡溶解后用底物緩沖液稀釋配制。TMB顯色劑是光敏感性的，避免暴露在強(qiáng)光下。
9.清洗玻璃容器時(shí)，用1N的酸（HCL和H2SO4）*洗滌，然后用蒸餾水洗滌及遍。
10. 結(jié)果一定要以吸光度來判斷，不能憑目測判斷。
11. 本試劑盒應(yīng)貯存于+2--+8℃。