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質(zhì)體DNA 酵解反應與洋菜膠體電泳分析
閱讀:658 發(fā)布時間:2010-7-7本實驗以BamHI 與HindIII 酵解pBlueGus,并以洋菜電泳分析產(chǎn)物。
儀器用具:微?離心機;37℃恒溫水槽;Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器;UV transilluminator;防護面罩;拍?得相機
藥品試劑:
質(zhì)體pBlueGus DNA ;限制酶BamHI 與HindIII (Roche);10×Reaction buffer 2 (Roche);10×Reaction buffer 3 (Roche);Agarose;1×TAE 電泳緩沖液;DNA分子?標記 (??DNA/HindIII 或100 bp ladder, 0.5 μg/mL);10×追蹤染劑 (0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol; 0.1 M EDTA;50% glycerol);Ethidium bromide (500 μg/mL);拍?得667 底片
方法步驟:
1) 取兩支1.5 mL微?離心管,分別標示為 #1 與 #2 的后,依下表所?順序,
逐一加入酵解反應所需各項物質(zhì) (體積單位為 μL)。注意:應等所有成份?加?的后,再加入限制酶。
2) 以手指頭輕彈微?離心管,以?均勻混合管中各項物質(zhì)。
3) 離心數(shù)秒后,放置于37℃恒溫水槽作用1~2 h。
4) 請?用這一段時間參照『基本操作技術』所描述的步驟準備一片1.2%洋菜膠體。
?? Ethidium bromide 是強?致癌物質(zhì),嚴禁戴著手套到處?摸!
5) 自恒溫水槽取出微?離心管,離心數(shù)秒后暫存冰中備用。
6) 擬進?電泳分析時,請拿出3 支1.5 mL 微?離心管,分別標示為 #1, #2與 #3,并依下表所示在各離心管逐一加入適?的DNA 與10×追蹤染劑(體積單位為 μL)。
7) 把膠片移至電泳槽,注入適?電泳緩沖液,以微?移液器P20 逐一將樣本
吸入注出數(shù)次使混合均勻,并小心注入膠片的樣本槽中。
8) 接好電極線以定電壓100 V 進?電泳,待追蹤染劑移動至膠體三分的二處時,關閉電源,將膠體移至UV transilluminator box,以拍?得相機拍照 。
?? DNA泳動方向為 (-) 向 (+)。 此外,在UV transilluminator box上直接觀察DNA色帶時,沒戴眼鏡的同學應戴上護目鏡或面罩,以避免UV灼傷;含有ethidium bromide的洋菜膠體請丟至容器中!