之前已分別構(gòu)筑出GUS 基因的表現(xiàn)質(zhì)體pQG11，?要?啟動子T5promotor 的啟動受到?好的調(diào)控，應(yīng)進一步將pQG11 轉(zhuǎn)形至大腸桿菌M15[pREP4]。 M15[pREP4] 可持續(xù)表現(xiàn)lac repressor，pQG11 上用以驅(qū)動GUS基因表現(xiàn)的T5 promoter 的活性將因而受到抑制，但一旦加入IPTG 就能誘導(dǎo)GUS基因大?表現(xiàn)。 在這一節(jié)的實驗里，我們將分別自經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)與未經(jīng)誘導(dǎo)的pQG11/M15[pREP4] 菌體抽取total RNA，以?以?方雜合反應(yīng)分析GUS mRNA的表現(xiàn)情形。 下面所采用的方法適用于大腸桿菌及其他革?氏陰性菌total RNA的抽取，實驗進?時先以lysozyme 分解細胞壁，再以sodium dodecyl sulfate （SDS）?解原生質(zhì)膜 （Summers, 1970; Ausubel et al., 2005）；的后加入適?的氯化鈉溶液將SDS、蛋白質(zhì)及大腸桿菌的染色體DNA 一并沉淀下?，并以離心法移除，存?于上清液的RNA 則以酒?沉淀。 實驗過程所使用的RNase 抑制劑為DEPC。
儀器用具：恒溫震蕩培養(yǎng)箱37℃；冰??；微?離心機；分光光?計 （Hitachi U-1100 spectrophotometer）
藥品試劑：大腸桿菌菌株pQG11/M15[pREP4];LB 培養(yǎng)液;Ampicillin （100 mg/mL）;Kanamycin （25 mg/mL）;IPTG （1 M）;Protoplasting buffer （15 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.45 M sucrose; 8 mM EDTA, stored at 4℃）;Lysozyme （50 mg/mL）;Gram-negative lysing buffer （10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM NaCl; 1 mM sodium citrate; 1.5% SDS）;Diethylpyrocarbonate （DEPC）;飽和氯化鈉溶液 （以40 g氯化鈉溶解于100 mL dH2O/DEPC）;酒?及70%酒?
方法步驟：
大腸桿菌pQG11/M15[pREP4] 的培養(yǎng)：
1） 將pQG11/M15[pREP4] 接種于2 mL含ampicillin （100 μg/mL） 及kanamycin（25 μg/mL） 的LB培養(yǎng)液，于37℃震蕩培養(yǎng)過夜。
2） 隔日早晨，取0.5 mL pQG11/M15[pREP4] 過夜培養(yǎng)液，加入25 mL 含有ampicillin （100 μg/mL） 與kanamycin （25 μg/mL） 的LB 培養(yǎng)液，于37℃震蕩培養(yǎng)2 h。
3） 加入25 μL 1 M IPTG，繼續(xù)放置于37℃震蕩培養(yǎng)。
4） 經(jīng)過4 h 后，取出pQG11/M15[pREP4] 培養(yǎng)液，開始進?RNA 制備工作。
制備RNA：注意！進?以下RNA 制備實驗時，除?使用依上述步驟所準(zhǔn)備的pQG11/M15[pREP4] 培養(yǎng)液外，請記得向助教?取未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的pQG11/M15[pREP4] 培養(yǎng)液當(dāng)做對照組。
1） 取出4 支1.5 mL 微?離心管，分別標(biāo)示為I-1, I-2, U-1 與U-2。
2） 取3 mL 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的pQG11/M15[pREP4] 培養(yǎng)液平均分置于微?離心管I-1 與I-2。
3） 取3 mL 未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的pQG11/M15[pREP4] 培養(yǎng)液平均分置于微?離心管U-1 與U-2。
4） 以8,000 rpm （4℃） 離心5 min，小心倒掉上清液，并以微?移液器盡?吸掉殘?的液體。
5） 各加入0.5 mL protoplasting buffer，以微?移液器將大腸桿菌充分懸浮。
6） 再加入1 mL protoplasting buffer 與12 μL 50 mg/mL lysozyme，混合均勻的后，移置于冰浴中作用15 min。
7） 以7,000 rpm 于4℃離心5 min。
8） 小心倒出上清液，并以微?移液器盡?吸掉殘?的液體。
9） 各加入75 μL gram-negative lysing buffer 及2 μL DEPC，以微?移液器小心懸浮沉淀于管底的大腸桿菌原生質(zhì)體，并離心數(shù)秒。 在以微?移液器懸浮大腸菌原生質(zhì)體時，一旦pellet 被充分打散即應(yīng)停止懸浮動作，以避免大腸菌DNA 斷?可能造成的問題。 DEPC 可能是一種致癌物質(zhì)，使用時請在抽氣櫥內(nèi)操作。
10） 將微?離心管放入37℃恒溫水槽作用5 min。
11） 作用完畢的后，將離心管移到冰浴中靜置5 min。
12） 加入38 μL 飽和氯化鈉溶液，以手指頭輕彈管壁，充分混合均勻。
13） 靜置于冰浴中作用10 min，此時應(yīng)有白色沉淀出現(xiàn)。
14） 以13,000 rpm 于4℃離心10 min。
15） 將上清液移至新的微?離心管，并加入0.3 mL 酒?。
16） 混合均勻后將離心管放置于 -20℃過夜，以?沉淀RNA。 RNA 在酒?內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定，?須長期保存，可停在這一步。
17） 以14,000 rpm 于4℃離心15 min。
18） 小心倒掉上清液后，加入300 μL 70%酒?。
19） 以14,000 rpm 于4℃離心5 min 的后，小心倒掉上清液。
20） 將微?離心管倒置于桌面上30 min，以?風(fēng)干RNA。
21） 將RNA溶解于30 μL dH2O/DEPC。
22） RNA定?：取5 μL RNA，加入995 μL dH2O/DEPC稀釋的后，以分光光?計測其在260 nm與280 nm的吸光值 （記得使用石英測光管），并計算RNA的濃?與A260/A280的比值。 RNA溶液在260 nm的吸光值為1.0 時，則濃?相當(dāng)于40 μg/mL，而其A260/A280的比值應(yīng)為1.7~2.0 （DNA則為1.8 左右）。 這四個RNA 樣本將于后續(xù)實驗中，分別以甲醛洋菜膠體電泳進?分析