在生物醫(yī)學(xué)和臨床研究實踐中，經(jīng)常需要檢測兩種不同物質(zhì)是否在同一樣品中共存或同一種細胞中共存，因此出現(xiàn)了免疫組織化學(xué)雙重染色。此方法有幾種類型，包括免疫酶組織化學(xué)和免疫熒光細胞化學(xué)法結(jié)合；同一切片的再度染色法（先對*種抗原染色，陽性部位拍照，再用酸處理使抗原抗體解離，繼之，對第二種抗原染色、拍照）；兩種酶標(biāo)抗體3又重染色（分別用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶標(biāo)記第二抗體．用間接法分別顯示A和B抗原，如兩種一抗來自同一種屬，常有重疊染色）；不同種屬來源的抗體雙重染色。目前，zui常用的是zui后一種方法。

不同種屬來源的抗體雙重染色，兩種抗體間無交又反應(yīng)．特異性較高，即使細胞內(nèi)抗原量很少也能檢測。但是，當(dāng)兩種抗原存在于同一部位而其中之一濃度較高，占優(yōu)勢時將妨礙另一種抗原染色，此種情況應(yīng)分別染色，首先染色含量較少的抗原，再顯示含量豐富的抗原。在該方法中應(yīng)用zui多的是把SABC法或SP法的實驗流程重復(fù)兩次，其中兩種不同特異性抗體（可以是小鼠或大鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體的任何兩個組合），與一抗對應(yīng)的不同種屬生物素化二抗和兩種不同顯色系統(tǒng)。即可將不同部位或相同部位的兩種抗原顯示出來。該方法用于石蠟切片時應(yīng)考慮所選擇的兩個抗體的修復(fù)方法應(yīng)該一致或一個抗體的修復(fù)對另一個抗體的染色結(jié)果沒有影響。

SP法雙重染色步驟
1～6步驟與SABC法相同，但無需使用生物素阻斷劑：
7．切片加入A特異性抗體（如兔抗A抗體），4=C過夜孵育后，PBS沖洗3次，每次5分鐘
8.滴加生物素化二抗（如抗兔二抗），室溫孵育切片10分鐘，繼而PBS沖洗3次，每次5分鐘；
9.滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—堿性磷酸酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘
10．堿性磷酸酶顯色液（BCIP／NBT）顯色（紫藍色）．PBS沖洗3次，每次5分鐘；
11．滴加0．05％鹽酸，室溫10分鐘（可避免已顯色的抗原褪色）；
12．滴加抗小鼠二抗同種屬的非免疫血清，37~C孵育10分鐘；
13．滴加B特異性抗體（如小鼠抗B抗體），4~C過夜孵育。PBS沖洗3次，每次5分鐘；
14．滴加生物素化抗小鼠二抗，室溫孵育切片10分鐘。PBS沖洗3次，每次5分鐘：
15．滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶，室溫孵育10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘
16．過氧化物酶顯色液（AEC）顯色（鮮紅色）．PBS沖洗3次，每次5分鐘
17．蘇木精復(fù)染細胞核；
18．水溶性封片劑封片。

在使用SP法雙重染色之前需要對待測抗原的性質(zhì)、二抗的種屬類型和顯色系統(tǒng)進行詳細設(shè)計。購買免疫組化雙染試劑盒時；應(yīng)選擇與設(shè)計方案相同的配套試劑。在選擇一抗時應(yīng)避免定位在細胞的同一部位（如胞核、胞漿和胞膜）的兩種抗原，如果不可避免，選擇免疫熒光組織細胞化學(xué)雙重染色方法，因為兩種不同顏色的熒光重疊后呈現(xiàn)另一種顏色的熒光（如紅色熒光與綠色熒光重疊呈現(xiàn)黃色熒光），它比SP法的顯色系統(tǒng)更容易區(qū)別和辨認陽性結(jié)果。

在進行雙重染色之前，必須對所選擇的一抗分別進行單獨染色預(yù)實驗，預(yù)實驗條件必須與雙染條件相同，在觀察預(yù)實驗結(jié)果和抗體定位正確后，再進行雙染實驗。