[器材和試劑]
通用設(shè)備及試劑
● 滅菌水
● 無菌微量離心試管
● 無菌移液槍及移液管槍頭
● 微型離心機(jī)
● 臺式離心機(jī)
A部分
● 無菌的0．2ml的細(xì)壁聚丙烯微型離心管
● pfuDNA聚合酶（Stratagene）
● 10×pfu緩沖液， 由提供PfuDNA聚合酶的廠商提供
● dNTP混合液（每個10mmol/L）
● λGTll正向引物 （NeW England Biolabs， #1218 5’-GGTGGCGACGACCCTGGAGCCCG-3’）
● λGTll反向引物（New England Biolabs， #1222 5’-TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3’）
● 已制備好的SfiI-NotIλGTll cDNA文庫[滴度≥109pfu（噬菌斑形成單位）/ml]
● 礦物油
● 自動PCR擴(kuò)增儀
B部分
● QIAquickPCR擴(kuò)增試劑盒（Qlagen）
● 限制性內(nèi)切酶及相應(yīng)的10×限制性內(nèi)切酶緩沖液
C部分
● 瓊脂糖
● TAE緩沖液（50X）：2 mol/LTris-乙酸鹽，50mmol/LEDTA（pH 8．0）
● 0．5mg/ml溴化乙錠（1000×stock）
● 6×凝膠上樣液[0.25%（w/v）溴酚藍(lán)，0．25%（w/v）二甲苯腈藍(lán)FF以及30%（體積分?jǐn)?shù)）的甘油水溶液]
● 瓊脂糖凝膠電泳盒
● UV transilluminator
● 無菌的15m1的聚丙烯管
● 無菌刀
● Geneclean（Qbiogene）或Wizard PCR DNA預(yù)純化系統(tǒng)（Promega）
● DNA濃度測量試劑盒（Invitrogen）
[方法]
A.PCR擴(kuò)增cDNA插入片段
1．在冰浴中將以下成分加到0．2m1微量離心管中（執(zhí)行10步反應(yīng)）
● 水，36．5ul
● 10×Pfu緩沖液，5．0ul
● 10mmol/L dNTP， 1．5ul
● λGTll正向引物 （10umol/L），2．5ul
● λGTll反向引物（10umol/L），2．5ul
● 已制備好的Sfi-NotIλGTll cDNA文庫，1．Oul
● PfuDNA聚合酶（2．5U/ul），1．0ul
2．混合反應(yīng)物并用50ul的礦物油覆蓋。
3．在95℃下使模板變性2分鐘，按如下操作執(zhí)行25次循環(huán)： （a）95℃變性1分鐘； （b）50℃退火1分鐘；（c）72℃延伸3分鐘（zui后一輪的延伸時間增加到7分鐘）。
B．純化并用限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的cDNA片段
1．純化在A部分中用QIAquick PCR擴(kuò)增儀器得到了PCR產(chǎn)物，每兩個PCR反應(yīng)用一個旋轉(zhuǎn)柱并在30ul的水中提取純化的PCR產(chǎn)物。
2．收集提取的PCR產(chǎn)物，如下所示建立限制性消化：
● 水，25ul
● 純化的PCR產(chǎn)物，150ul
● 10X限制性內(nèi)切酶緩沖液，20ul
● 限制性內(nèi)切酶（10U/ul），5ul
3．在適當(dāng)?shù)臏囟认?小時。
C.對擴(kuò)增和消化的cDNA片段按大小進(jìn)行分餾并重新獲得cDNA片段
1．在0.8%（w/v）瓊脂糖/TAE凝膠（允許電壓為1～5V/cm）上純化限制酶的消化產(chǎn)物。
2．用無菌刀小心地切除靶區(qū)域（500～3000bp），將凝膠片轉(zhuǎn)移到15ml的聚丙烯管中。注意：增加了跑膠時間會導(dǎo)致靶區(qū)域的擴(kuò)大。
3．用Geneclean或WizardPCRDNA預(yù)純化系統(tǒng)來純化瓊脂糖凝膠分離的片段，在50ul的水中重新得到擴(kuò)增的cDNA。
4．用DNA濃度測量試劑盒來估計DNA的濃度。