公司動(dòng)態(tài)
利用血清篩選噬菌體文庫的篩選
閱讀:684 發(fā)布時(shí)間:2010-8-2[器材和試劑]
● PBBST(PBS,0.1%BSA,0.1%Tween-20)
● 磁分離儀(Dynal)
● f1Rl紫外滅活噬菌體
● 洗脫緩沖液(用甘氨酸將0.1mol/L HCl調(diào)整到pH 2.2,1mg/mlBSA)
● 2rn01/L Tris-HCl pH 9.0
● LB-瓊脂培養(yǎng)基(1%細(xì)菌用胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,1.5%細(xì)菌用瓊脂,0.17Trl01/L NaCl,pH 7.2)
● LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG[LB-瓊脂培養(yǎng)基,50/xg/m1青霉素,35ug/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷),35p.g/m11PTG(異丙基硫代半乳糖苷)]
[方法]
1.將已包被的磁珠轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中,加入50ul血清樣品PBBST液,zui后定容至1m1。4℃轉(zhuǎn)輪孵育12~16小時(shí)。
2.在4℃下,用PBBST洗滌磁珠4次,每次30分鐘;每次洗滌10ml。
3.再次將磁珠懸浮在PBBST中, 內(nèi)含1×1013個(gè)UV滅活nRl,終體積為1ml。4℃置于轉(zhuǎn)輪上3~4小時(shí)。
4.在上述混合物中加入2X10”個(gè)文庫噬菌體顆粒,4℃溫和攪動(dòng)12~16小時(shí)。
5.在4℃下,用10m1PBBST洗滌磁珠6~7次,除去未連接的噬菌體;每次洗滌后,用磁分離儀除去液體。
6.室溫下,用0.5ml洗脫緩沖液溫和攪動(dòng)孵育磁珠30分鐘,洗脫結(jié)合噬菌體。
7.將洗脫產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)Eppendorf管中,再加入50ul的2rll01/L Tris-HCl,pH 9.0,中和。
8.在LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG平板上,按轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)滴定洗脫噬菌體(A)和未吸附噬菌體(N)。