在篩選和測(cè)序后，下一步是將單克隆的結(jié)合性用以下三種形式顯示出來：首先，得自靶標(biāo)器官的、相對(duì)于無插入序列的噬菌體及其他器官和組織而數(shù)量增加的噬菌體；其次，在器官或組織的脈管系統(tǒng)上進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色時(shí)的陽性染色；第三，我們合成、注射以及分析熒光標(biāo)記的同源多肽的生物分布，以此來建立多肽在噬菌體環(huán)境之外的活性。

1 體內(nèi)和體外的結(jié)合性

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案10．2可以快速檢測(cè)幾個(gè)單克隆在體外的結(jié)合性，接下來根據(jù)可以檢測(cè)單克隆在體內(nèi)的結(jié)合性。陽性克隆具有得自靶標(biāo)器官的、相對(duì)于無插入序列的噬菌體及其他器官、組織和細(xì)胞數(shù)量增加的噬菌體；可能在對(duì)照器官和組織中具有比在無插入序列的噬菌體中更低的本底；而且常常比噬菌體源群落表現(xiàn)得更好。

對(duì)于一個(gè)單克隆，體外結(jié)合與體內(nèi)定位之間的比較也能提供一些關(guān)于其受體分布的信息。例如，在體內(nèi)篩選中發(fā)現(xiàn)了定位于肺的GFE—1多肽，并發(fā)現(xiàn)與其他器官和組織比較時(shí)，它僅定位于體內(nèi)的肺脈管系統(tǒng)。然而，當(dāng)進(jìn)行體外試驗(yàn)時(shí)，該多肽與肺和腎的原代細(xì)胞制備液都能結(jié)合。在發(fā)現(xiàn)了此多肽的受體——膜二肽酶以后，該原因變得清晰：膜二肽酶不僅在肺脈管系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，而且在肺和腎的實(shí)質(zhì)細(xì)胞（parenchymal cell）中也都存在；它具有一個(gè)能將體內(nèi)數(shù)據(jù)和體外數(shù)據(jù)正確起來的分布。

2 免疫組化和免疫熒光

比起在前面實(shí)驗(yàn)方案中采用的感染性檢測(cè)，免疫組化和免疫熒光的靈敏度較低，因此在我們的實(shí)驗(yàn)方案中，有可能陽性脈管系統(tǒng)有染色，而在陰性對(duì)照器官中的本底則未著色。

對(duì)于篩選中的免疫組化和免疫熒光，我們進(jìn)行了同樣的對(duì)照比較：噬菌體比噬菌體和靶標(biāo)比靶標(biāo)。在多種器官和組織中尋找無插入序列的噬菌體的存在時(shí)將產(chǎn)生一組數(shù)據(jù)。、肝臟既是噬菌體免疫組化的陽性對(duì)照也是其陰性對(duì)照，因?yàn)镵upffer細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）的著色是強(qiáng)陽性的；然而，脈管系統(tǒng)是陰性的。Kupffer細(xì)胞著色的原因是通過這些細(xì)胞從循環(huán)中消除了噬菌體。

對(duì)于針對(duì)fd和T7多克隆血清的組織學(xué)程序的陰性對(duì)照，應(yīng)該包括純化的兔血清，或用不相關(guān)的抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行類似免疫而得到的IgG。把這些以相同的濃度用作初級(jí)抗體。

3 結(jié)合的特異性

在用噬菌體計(jì)數(shù)、免疫組化和免疫熒光進(jìn)行觀測(cè)時(shí)，那些合成的同源多肽可能減少或消除對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合，我們通過這一點(diǎn)的顯示確定特異性。一般將一個(gè)結(jié)合性或定位性的多肽轉(zhuǎn)入單價(jià)的T7 Selecg—1載體或使用單獨(dú)的T7 Select415-1克隆，并從lmg/m1的多肽溶液開始（大約lmmol/L）繪制抑制曲線，然后以半對(duì)數(shù)增量（half-1og increment）+0．01tumol/L逐步增加。如果使用的是單價(jià)展示多肽，那么從抑制曲線測(cè)定的IC50就是多肽的表觀Kd值。