載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質(zhì)粒DNA是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。
一、一個合格質(zhì)粒的組成要素
復(fù)制起始位點Oril 即控制復(fù)制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復(fù)制起始點。而真核生物DNA分子有多個復(fù)制起始位點。
?？股乜剐曰?可以便于加以檢測，如Amp+l ,Kan+
＃多克隆位點MCS 克隆攜帶外源基因片段l
＃P/E 啟動子/增強子l
＃Termsl 終止信號
＃加poly（A）信號l 可以起到穩(wěn)定mRNA作用
二、如何閱讀質(zhì)粒圖譜
*步：首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）
第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。
（1）Ampr 水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。
（2）tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。
（3）camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418（長那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DN***段。一般來說，外源DN***段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。
第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實驗?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。
啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號
＃啟動子－促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序，這個DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。l
＃增強子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負(fù)增強子，負(fù)調(diào)控序列。l
＃核糖體結(jié)合位點/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體的兩個結(jié)合位點，對于原核而言是AUG（起始密碼）和SD序列。l
＃轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的zui后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號。結(jié)構(gòu)基因的zui后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號。l回答有人之前提出的一個問題：為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條DNA鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.
三、介紹一下關(guān)于載體的知識（雖然課本上都有寫）
1. 什么是載體
即要把一個有用的基因（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。
P.S.基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA
2. 載體的分類
＃按功能分成：
（1）克隆載體都有一個松弛的復(fù)制子，能帶動外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴增。它是用來克隆和擴增DN***段（基因）的載體。（所以有時實驗時擴增效率低下，要注意是不是使用的嚴(yán)謹(jǐn)行載體）
（2）表達(dá)載體具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。
＃按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分：（1）原核載體 （2）真核載體（3）穿梭載體（sbuttle vector）指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以運載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）.
P.S. 穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個復(fù)制子，以確保兩類細(xì)胞中都能擴增。
3. 基因工程載體的3個特點：
（一）都能獨立自主的復(fù)制：載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區(qū)域，如MCS，插在其中的外源DN***段，能被動的跟著載體一起復(fù)制/擴增，就像載體的正常成分一樣。
（二）都能便利的加以檢測：如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細(xì)胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長時，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。
（三）都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來。
4. 載體的選擇和制備：選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。
載體選擇主要考慮下述3點：
【1】構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。
【2】.載體的類型：
--－（1）克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大小（大選大，小選小）。如<10kb選質(zhì)粒。
--－（2）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。
--－（3）對原核表達(dá)載體應(yīng)該注意3點：
------①選擇合適的啟動子及相應(yīng)的受體菌；
------②用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時注意克服4個困難和閱讀框錯位；
------③表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。
【3】載體MCS中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。
選用質(zhì)粒（zui常用）做載體的4點要求：
①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；
②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個。
③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；
④必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（試一試）。
無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體DNA進(jìn)行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。
質(zhì)粒載體 質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。其特點如下： ?、偈侨旧|(zhì)外的雙鏈共價閉合環(huán)形DNA（covalently closed circuar DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2-300kb之間，＜15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，＞15kb的大質(zhì)粒則不易提取。 ②能自主復(fù)制，是能獨立復(fù)制的復(fù)制子（autonomous replicon）。一般質(zhì)粒DNA復(fù)制的質(zhì)?？呻S宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。按質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類：嚴(yán)緊控制（stringent control）型質(zhì)粒的復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個細(xì)胞中只有1個到十幾個拷貝；另一類是松弛控制（relaxed control）型質(zhì)粒，其復(fù)制宿主不偶聯(lián)，每個細(xì)胞中有幾十到幾百個拷貝。每個質(zhì)粒DNA上都有復(fù)制的起點，只有ori能被宿主細(xì)胞復(fù)制蛋白質(zhì)識別的質(zhì)粒才能在該種細(xì)胞中復(fù)制，不同質(zhì)粒復(fù)制控制狀況主要與復(fù)制起點的序列結(jié)構(gòu)相關(guān)。有的質(zhì)粒的可以整合到宿主細(xì)胞染色質(zhì)DNA中，隨宿主DNA復(fù)制，稱為附加體，例如細(xì)菌的性質(zhì)粒就是一種附加體，它可以質(zhì)粒形式存在，也能整合入細(xì)菌的DNA，又能從細(xì)菌染色質(zhì)DNA上切下來。F因子攜帶基因編碼的蛋白質(zhì)能使兩個細(xì)菌間形成纖毛狀細(xì)管連接的接合（conjugation），通過這細(xì)管遺傳物質(zhì)可在兩個細(xì)菌間傳遞。 ?、圪|(zhì)粒對宿主生存并不是必需的。這點不同于線粒體，線粒體DNA也是環(huán)狀雙鏈分子，也有獨立復(fù)制的調(diào)控，但線粒體的功能是細(xì)胞生存所必需的。線粒體是細(xì)胞的一部分，質(zhì)粒也往往有其表型，其表現(xiàn)不是宿主生存所必需的，但也不妨礙宿主的生存。某些質(zhì)粒攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下生存，例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥性基因，如編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱為抗藥性質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒，帶有R質(zhì)粒的細(xì)菌就能在相應(yīng)的抗生素存在生存繁殖。所以質(zhì)粒對宿主不是寄生的，而是共生的。
