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改善RNA提取的4點(diǎn)建議

閱讀:1161      發(fā)布時(shí)間:2013-7-29
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加利福尼亞州科學(xué)院(California Academy of Sciences)的Jack Dumbacher博士目前正開展轉(zhuǎn)錄組和小RNA的分離,以便鑒定宏基因組病毒序列。他的研究目標(biāo)是了解病毒與宿主的共生關(guān)系。Dumbacher博士為改善RNA提取提出了幾點(diǎn)建議。

優(yōu)化RNA的保存

研究小組常常從偏遠(yuǎn)地區(qū)采集樣本,如熱帶雨林或珊瑚礁。他們的大挑戰(zhàn)在于無(wú)法用液氮迅速冷凍樣本,而RNA在乙醇中逐步降解。于是,他們用拭子蘸取鳥的泄殖腔,并放在RNA穩(wěn)定劑或其他包含4M 硫氰酸胍(GITC)的溶液中。由于鹽的濃度,一些RNA穩(wěn)定劑可能會(huì)給RNA的分離造成困難。當(dāng)然,如果能解決冷藏問題,保存RNA的好辦法是采集后立即用液氮冷凍樣本,并保存在-80°C。
確保良好的分離
GITC溶液通常用于RNA提取中細(xì)胞和病毒顆粒的裂解,同時(shí)防止RNase的酶活。在這種情況下,研究小組必須在裂解之前進(jìn)行完整病毒的分離,以便與細(xì)胞分開。在現(xiàn)場(chǎng),他們用0.2 µm的過濾器來(lái)過濾較小的病毒顆粒。而較大的顆粒(如完整細(xì)胞)則被留下。其他實(shí)驗(yàn)室若使用冷凍的組織樣本,則必須快速*地勻漿。無(wú)論選擇哪種方法,始終會(huì)有些基因組(gDNA)存在。具體有多少則在很大程度上取決于用戶的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)。

盡量避免RNase

在實(shí)驗(yàn)室中,避免已純化的RNA接觸到內(nèi)源和外源的RNase關(guān)重要。在純化開始時(shí),外源RNase不怎么成為威脅。但在沒有了變性劑(如GITC)的保護(hù)以及RNA純化完成后,你就要避免接觸RNaseRNase抑制劑隔離殘留的RNase,適合大部分應(yīng)用,特別是那些包含內(nèi)源RNase的應(yīng)用??茖W(xué)院的比較基因組實(shí)驗(yàn)室使用經(jīng)DEPC處理的水。DEPC通過堿基的組氨酸修飾而讓RNase失活。同時(shí)記住,及時(shí)更換手套。

提高RNA的產(chǎn)量

不同組織不同樣本的RNA產(chǎn)量會(huì)相差很大。對(duì)于Dumbacher博士而言,每個(gè)樣本的RNA量都很低。他們所獲得的RNA量取決于小鳥后一次進(jìn)食的時(shí)間,吃了什么。Dumbacher小組的下游應(yīng)用是新一代測(cè)序。他認(rèn)為,即使樣品的RNA含量很低,但在構(gòu)建文庫(kù)以及獲得終結(jié)果時(shí)還是會(huì)覺得不錯(cuò)。
若要提高組織樣本的RNA產(chǎn)量,避免過度勻漿或加熱。勻漿30秒,再休息30秒,可改善RNA的回收。同時(shí),用更多的水洗脫可釋放更多RNA。無(wú)論您的實(shí)驗(yàn)室采用何種下游技術(shù),成功的分析都取決于良好的RNA分離技術(shù)。孰巧,多試試一定行。

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