RNA的化學(xué)性質(zhì)比DNA活躍得多。RNA分子上緊鄰磷酸二脂鍵的2′羥基基團(tuán)能直接被RNA酶利用來作為活性因子,從而使得RNA酶無需金屬離子就能發(fā)揮活性。由于RNA酶在環(huán)境中廣泛存在,特別是RNase A,結(jié)構(gòu)極其穩(wěn)定,不能通過高溫高壓滅菌失活,因而極難消除,對(duì)保持RNA樣品的完整性構(gòu)成極大的威脅。由于RNase A類酶依賴于活性位點(diǎn)處的組氨酸殘基起催化作用,因此能被組氨酸烷化劑DEPC所抑制。
避免RNA酶的污染的方法:
1.塑料制品:盡可能使用無菌、一次性塑料制品。已標(biāo)明RNase-free的塑料制品,如沒有開封使用過,通常沒有必要再次處理。對(duì)于國(guó)產(chǎn)塑料制品,有些廠家提供的產(chǎn)品已達(dá)到RNase-free,可以直接使用,再次處理容易造成二次污染,得不償失。但原則上國(guó)產(chǎn)塑料制品處理后方可使用。處理方法如下:
(1)在玻璃燒杯中注入去離子水,加入焦碳酸二乙酯(DEPC)使DEPC的終濃度為0.1%。注意:DEPC有致癌之嫌,須在通風(fēng)柜中小心操作。
(2)將待處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
(3)在通風(fēng)柜中37℃或室溫下處理。
(4)將EDPC水溶液小心倒入廢液瓶中,用鋁箔封住含DEPC水處理過的塑料制品的燒杯,高溫高壓蒸氣滅菌少30分鐘。上述處理可以除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對(duì)RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。
(5)用合適的溫度(80-90℃)烘烤干燥,置于干凈處備用。
2.玻璃和金屬制品: 實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃和金屬器皿經(jīng)常有RNA酶污染,使用前必須于180℃干烤8小時(shí)或250℃烘烤3小時(shí)以上。另一種方法是用0.1%的DEPC水溶液浸泡。
3.電泳槽:用于RNA電泳的電泳槽應(yīng)用去污劑洗干凈,再用水沖洗,用乙醇干燥,然后灌滿3%的H2O2溶液,于室溫放置10分鐘,然后用0.1%DEPC處理過的水*沖洗電泳槽。好能留出一些玻璃器皿,塑料制品和電泳槽作上特殊標(biāo)記,存放在地點(diǎn),為RNA 實(shí)驗(yàn)。
4.移液器: RNase的又一污染源是移液器。根據(jù)移液器制造商的要求對(duì)移液器進(jìn)行處理。一般情況下采用用DEPC配制的 70%乙醇擦洗移液器的內(nèi)部和外部,基本達(dá)到要求。移液器金屬退頭器是RNA酶的一個(gè)重要來源,實(shí)驗(yàn)前好取下它。
5.溶液:用高壓滅菌的水和RNA研究的化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿??赡艿脑捜芤簯?yīng)用0.1% DEPC水于 37℃ 少處理12小時(shí),然后于100℃加熱15分鐘或在15 lbf/in2(1.034×105Pa)的高壓下蒸氣滅菌30分鐘。注:DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng),因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液,可存幾瓶新的,未開封的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。
6.研究人員: RNA酶廣泛存在于人的皮膚上,主要的潛在污染源是研究人員的手。因此,在準(zhǔn)備分離和分析RNA的材料和溶液時(shí),以及在涉及RNA的一切操作過程中,都應(yīng)戴一次性手套,接觸“臟的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能沾染上RNA酶,因此進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)勤換手套
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