次黃嘌呤

次黃嘌呤應(yīng)用：

生化試劑，制備生物培養(yǎng)基，例如HAT選擇性培養(yǎng)基的制備。

次黃嘌呤原理：

在單抗制備中，由于需要進(jìn)行選擇性殺死非目標(biāo)細(xì)胞，所以使用添加HAT的選擇性培養(yǎng)基，其依據(jù)是細(xì)胞中的DNA合成有兩條途徑：一條途徑是生物合成途徑（“D途徑”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA分子的合成提供原料。在此合成過程中，葉酸作為重要的輔酶參與這一過程，而HAT培養(yǎng)液中氨基蝶呤是一種葉酸的拮抗物，可以阻斷DNA合成的“D途徑”。另一條途徑是應(yīng)急途徑或補(bǔ)救途徑（“S途徑”），它是利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應(yīng)的核苷酸，兩種酶缺一不可。因此，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的效應(yīng)B細(xì)胞和兩個(gè)效應(yīng)B細(xì)胞融合的“D途徑”被氨基蝶呤阻斷，雖“S途徑”正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液中增殖的能力，一般10d左右會死亡。對于骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞而言，由于通常采用的骨髓瘤細(xì)胞是次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT）細(xì)胞，因此自身沒有“S途徑”，且“D途徑”又被氨基蝶呤阻斷，所以在HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤細(xì)胞與效應(yīng)B細(xì)胞相互融合形成的雜交瘤細(xì)胞，既具有效應(yīng)B細(xì)胞的“S途徑”，又具有骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液中長期增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來，并不斷增殖。通常HAT中，H（次黃嘌呤）的濃度為1×10-4M，A（氨基蝶呤）為4×10-7M，T（胸腺嘧啶）為1.6×10-5M，在HT培養(yǎng)基中，只需要不加氨基蝶呤，其它都同HAT。
HAT培養(yǎng)基的配制：
100×A（氨基喋呤） 貯存液：稱取1.76mg氨基喋呤溶于90ml超純水中，滴加1mol/L的NaOH 0.5ml助溶，待*溶解后，加1mol/L HCL 0.5ml 中和，再補(bǔ)加超純水到100ml。0.22um膜過濾除菌，小量分裝，-20℃保存。
100×HT貯存液：稱取136.1mg次黃嘌呤和38.8mg胸腺嘧啶核苷，加超純水到100ml，置45-50℃水浴中使*溶解，0.22μm膜過濾除菌，小量分裝，-20℃保存，臨用前37℃水浴中溶解。
HT培養(yǎng)基：82ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1ml HT（100×），1ml SP（100×），15ml滅能的犢牛血清。
HAT培養(yǎng)基：99ml HT培養(yǎng)基加入1ml A（100×）。

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