植物類胡蘿卜素含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號: BC4330

規(guī)格: 50T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

提取液：自備80%丙 酮，將丙 酮:蒸餾水（V:V）=4:1混合待用，提供一個125mL空瓶。

產品說明：

類胡蘿卜素( carotenoid)是一類重要的天然色素的總稱，普遍存在于動物、高等植物、真菌、藻類的黃色、橙紅色或紅色的色素之中。類胡蘿卜素是體內維生素A的前體，同時還具有抗氧化、免疫調節(jié)、抗癌、減輕心血管疾病及著色劑等作用。

植物的類胡蘿卜素存在于各種黃色質體或有色質體內；如黃葉，黃色花卉，黃色和紅色的果實和黃色塊根等組織，樣本通過溶劑萃取，分離提取類胡蘿卜素，在440±10nm處有特殊吸收峰。

大部分高等植物和藻類微生物的葉綠體內也含有類胡蘿卜素，類胡蘿卜素主要吸收藍紫光，而葉綠素a和葉綠素b既吸收紅光又可吸收藍紫光。所以針對含葉綠體的組織，為排除葉綠素a和葉綠素b對類胡蘿卜素的干擾，根據經驗公式先計算出葉綠素a和葉綠素b的含量，再進一步得出類胡蘿卜素的含量；針對不含葉綠素的組織可以直接根據類胡蘿卜素的經驗消光系數(shù)進行計算。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、1mL玻璃比色皿、天平、可調式移液槍、研缽/勻漿器、10mL離心管/試管、蒸餾水和丙 酮。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、新鮮植物葉片（去掉中脈）或其他組織用蒸餾水洗干凈，然后吸干表面水分，稱取約0.1g，剪碎放入研缽或勻漿器中。

2、加入1mL蒸餾水，少量試劑一（約10mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉入10mL離心管或試管中。

3、用提取液沖洗研缽或勻漿器，將所有沖洗液轉入10mL離心管或試管中，用提取液定容至10mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3h（期間可以顛倒混合2次），觀察底部組織殘渣接近于白色則提取全，若組織殘渣未全變白，繼續(xù)浸提至組織殘渣顏色接近于白色。

二、測定步驟

A、黃色或其他非綠色組織（不含葉綠體）類胡蘿卜素含量測定步驟：

1、分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至440nm，用提取液調零。

2、取上層浸提液1mL于1mL玻璃比色皿中，測定440nm處吸光值，記為A₄₄₀。

B、新鮮植物葉片或其他綠色組織（含葉綠體）類胡蘿卜素含量測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)多波長至470nm、646nm和663nm，用提取液調零。

2、 取上層浸提液1mL于1mL玻璃比色皿中，測定470nm、646nm和663nm處吸光值，分別記為A₄₇₀、A₆₄₆和A₆₆₃。

注意：若上層浸提液有殘渣，可吸取1.2mL上層浸提液置于1.5mL棕色EP管，常溫下4000r/min離心5min，再取上清液檢測。

三、類胡蘿卜素含量的計算：

A、黃色或其他非綠色組織（不含葉綠體）類胡蘿卜素含量的計算公式：

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=A₄₄₀÷（ε×d）×V 樣總×1000÷W×F=0.04×A₄₄₀×F÷W

V樣總：提取液總體積，0.01L；1000：單位換算系數(shù)，1g =1000mg；ε：類胡蘿卜素經驗消光系數(shù)，250 L/g/cm；d：比色皿光徑，1 cm；F：稀釋倍數(shù)；W：樣本質量，g。

B、新鮮植物葉片或其他綠色組織（含葉綠體）類胡蘿卜素含量的計算公式：

C_a（mg/L）=12.21×A₆₆₃-2.81×A₆₄₆

C_b（mg/L）=20.13×A₆₄₆-5.03×A₆₆₃

類胡蘿卜素濃度：C_c（mg/L）=（1000×A₄₇₀-3.27×C_a-104×C_b）÷229=4.367×A₄₇₀-0.014×C_a-0.454×C_b

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=C_c×V提取×F÷W =0.01×C_c×F÷W

V提?。禾崛∫后w積，0.01L；F：稀釋倍數(shù)；W：樣本質量，g。

注意事項：

1. 若不確定組織中有無葉綠素影響，可取樣本提取液采用分光光度計在波長400-700nm下進行掃描，看波長640-670nm之間有無波峰，有波峰則為有葉綠素，反之則無。

2. 當A超過1時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)F。

3. 為了避免色素見光分解，操作時應盡量避光，研磨或勻漿時應盡量縮短時間。

4. 提取液易揮發(fā)，操作時做好防護措施。

5. 測定大量樣本時，注意比色池中用來調零校正的比色皿中的提取液的液面位置，防止揮發(fā)造成誤差。

實驗實例：

1. 取0.1g黃花加入1mL蒸餾水、少量試劑一（約10mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉入10mL離心管，提取液沖洗研缽或勻漿器，用提取液定容至10mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3h（期間可以顛倒混合2次），按照操作步驟A，測得A440=0.316，計算含量得：

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=0.04×A₄₄₀÷W=0.1264 mg/g 質量。

2. 取0.1g綠蘿加入1mL蒸餾水、少量試劑一（約10mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉入10mL離心管，提取液沖洗研缽或勻漿器，用提取液定容至10mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3h（期間可以顛倒混合2次），按照操作步驟B，測得A470=0.746，A646=0.285，A663=0.686。計算得：

C_a（mg/L）=12.21×0.686-2.81×0.285=7.5752 mg/L；C_b（mg/L）=20.13×0.285-5.03×0.686=2.2865 mg/L；C_c（mg/L）=4.367×0.746-0.014×C_a-0.454×C_b=2.1137 mg/L；計算含量得：

類胡蘿卜素含量（mg/g 質量）=C_c×V提取÷W =0.01×C_c÷W=0.2114 mg/g 質量。

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