單寧含量檢測(cè)試劑盒說明書

紫外分光光度法

貨號(hào)：BC1390

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg單寧酸。臨用前加入1.175 mL提取液溶解為5000 nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，2-8℃保存兩周。

產(chǎn)品說明：

單寧又稱植物多酚，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物。單寧可作為潛在的生物標(biāo)記物；與蛋白質(zhì)結(jié)合的能力又稱為收斂性或澀性。其收斂性是多種生理活性的基礎(chǔ)，如止血、抗腫瘤、抗衰老等生理活性，也是影響產(chǎn)品口感的因素之一。

根據(jù)光譜特性，單寧在275nm下有較強(qiáng)的紫外吸收，通過利用活性炭能夠特異吸附單寧的性質(zhì)來檢測(cè)單寧含量。

技術(shù)指標(biāo)：

低檢出限：0.385 nmol/mL

線性范圍：0.39-18 nmol/mL

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、1mL石英比色皿、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、30-50目篩、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

將樣本烘干至恒重，粉碎，過30-50目篩之后，稱取約0.1g，加入2mL提取液（封口膜封口防止液體濺出），于70℃水浴，準(zhǔn)確提取30min，期間可搖晃數(shù)次。12000rpm，25℃，離心10min，取上清，用提取液定容至2mL，待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1. 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min，波長調(diào)至275nm，提取液調(diào)零。

2. 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將標(biāo)準(zhǔn)液用提取液稀釋為25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3. 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需1000µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4. 加樣表：

充分混勻震蕩5min，13000g 室溫離心20min。取上清液測(cè)定275nm下的吸光度，分別記為A測(cè)定管、A對(duì)照管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管，計(jì)算ΔA測(cè)定=A對(duì)照管-A測(cè)定管，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白管只需測(cè)1-2次。

三、單寧含量計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（y，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（x，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)定（x，ΔA測(cè)定）帶入公式計(jì)算樣本濃度（y，nmol/mL）。

2. 單寧含量計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單寧含量（nmol/mg prot）=y×V提取÷(V提取×Cpr) =y÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

單寧含量（nmol/g 質(zhì)量）=y×V提取÷W=2y÷W

Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V提取：提取液體積，2mL。

注意事項(xiàng)：

1. 如果測(cè)定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

2. 按蛋白濃度計(jì)算時(shí)，由于提取液中含有破壞蛋白結(jié)構(gòu)的成分，故需要重新提取蛋白進(jìn)行測(cè)定。

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