3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
紫外分光光度法
貨號(hào): BC2210
規(guī)格: 25T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑三：液體置于試劑瓶?jī)?nèi)EP管中。根據(jù)用量按照試劑三:蒸餾水為3:100的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2. 工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，根據(jù)需要取一定的量37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預(yù)熱10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說(shuō)明：
GAPDH（EC1.2.1.12）催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，與糖異生途徑、體內(nèi)血糖濃度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，在機(jī)體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。

1. 磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3-二磷酸甘油酸和NADH生成3-磷酸甘油醛、無(wú)機(jī)磷和NAD⁺，340nm處測(cè)定NADH的減少量可反映GAPDH活性的高低。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
血清（漿）：直接檢測(cè)。
二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 操作表：在1mL石英比色皿中分別加入下列試劑：

三、GAPDH酶活計(jì)算
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GAPDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=1072×ΔA÷Cpr
2、按樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GAPDH酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=1072×ΔA÷W
3、按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GAPDH酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（500×V樣÷V樣總）÷T=2.14×ΔA
4、按照血清（漿）體積計(jì)算
酶活定義：每mL樣本每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GAPDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷V樣÷T= 1072×ΔA
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.001L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間：5min；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
注意事項(xiàng)：

1. 當(dāng)A1小于0.8或ΔA大于0.7時(shí)，建議將樣本稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

2. 空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過(guò)0.01。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g兔腎臟加入1mL提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min，取上清置冰上，之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管=A1測(cè)定-A2測(cè)定=0.815-0.158=0.657，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.865-0.864=0.001，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.656，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：GAPDH酶活（U/g質(zhì)量）=1072×ΔA÷W=7032.32 U/g質(zhì)量。

2. 取0.1g三葉草加入1mL提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min，取上清置冰上，之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管=A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.026-1.017=0.009，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.865-0.864=0.001，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.008，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：GAPDH酶活（U/g質(zhì)量）= 1072×ΔA÷W=85.76 U/g質(zhì)量。

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