DPPH自由基清除能力檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC4750

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制： 

1、 試劑一：無水乙醇自備；

2、 試劑二：粉劑置于瓶內(nèi)EP管中。臨用前加入6.08 mL試劑一振蕩溶解，用不完的試劑可于-20℃保存1個月，建議分裝保存，避免反復(fù)凍融；臨用前根據(jù)試驗所需量按照試劑二：試劑一（V:V）= 4：21的比例配制成工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，用不完的工作液可于2-8℃保存一周；

3、 試劑三：10 mg維生素C。臨用前加入1 mL提取液，充分振蕩溶解，配成10 mg/mL維生素C溶液，2-8℃保存兩周；用于陽性對照。

產(chǎn)品說明：

DPPH自由基一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，是樣本抗氧化能力的重要指標(biāo)之一，廣泛應(yīng)用于抗氧化類食品、保健品及藥品的研究中。

DPPH自由基有單電子，其醇溶液呈紫色，在515 nm處有強吸收。當(dāng)有抗氧化劑存在時，DPPH自由基被清除，其溶液顏色變淺，515 nm的吸光度下降，在一定范圍內(nèi)其吸光度的變化與自由基被清除的程度成正比。本試劑盒中，通過吸光度下降的程度來反映樣本清除DPPH自由基的能力。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋、臺式離心機、無水乙醇、研缽/粉碎機、烘干箱、30~50目篩和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本的制備（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

（1）植物樣本的制備：將新鮮樣本置于60℃烘箱烘干至恒重，研缽研碎（或粉碎機粉碎），過30~50目篩。稱取約0.05 g樣本，加入1 mL提取液，40℃水浴浸提30 min。室溫10000 rpm 離心10 min，取上清，置冰上待測。

（2）紅酒、果汁等液體樣本：吸取100 μL樣本溶液加入900 μL提取液，旋渦振蕩混勻，室溫10000 rpm 離心10 min，取上清，置冰上待測。

（3）提取物或者藥物：可用提取液配制成一定濃度，如5 mg/mL。

注意：不同樣本清除DPPH自由基的能力可能相差很大，為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，樣本要根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整（如清除率大于90%，建議將提取的樣本用提取液進(jìn)行稀釋；清除率小于5%，建議加大烘干樣本

質(zhì)量或液體樣本體積進(jìn)行提?。?/span>

二、測定步驟

1、分光光度計預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至515 nm，無水乙醇調(diào)零。

2、陽性對照的準(zhǔn)備：若需要線性關(guān)系，建議將10 mg/mL的維生素C溶液用提取液配制成0.3、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL的維生素C溶液待用，稀釋可參考下表；若需要清除率約為100%的陽性對照，則建議將10 mg/mL維生素C溶液用提取液配制成大于0.3 mg/mL的維生素C溶液待用。

備注：實驗中每個陽性對照管需25µL試劑三。 

3、操作表：在1.5 mL EP管中分別加入下列試劑

三、計算公式

1、陽性對照的自由基清除率計算公式：

DPPH自由基清除率D_VC% =[(A空白-A陽性對照)÷A空白]×100%

2、樣本的自由基清除率計算公式：

DPPH自由基清除率D% =[[A空白-(A測定-A對照)]÷A空白]×100%

注意事項：

1、不同樣本清除DPPH自由基的能力可能相差很大，如果要比較不同樣本的DPPH自由基清除能力，建議對于同一批樣本加入等量的樣本，紅酒、組織勻漿、果汁等液體樣本加入同樣體積，提取物（或者藥物）配制成同樣濃度。在比較時，將樣本根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，比較同樣濃度（相同稀釋倍數(shù)）的清除率大小。

2、樣本建議當(dāng)天提取當(dāng)天檢測。

實驗實例：

1、 稱取0.05g益母草葉片加入1mL提取液進(jìn)行樣本處理，離心取上清后按測定步驟操作，測得A空白=1.037、A對照=0.088、A測定=0.228，根據(jù)計算公式得：

DPPH自由基清除率D% =[[A空白-(A測定-A對照)]÷A空白]×100%=86.5%。

2、 取100μL紅酒加入900μL提取液進(jìn)行樣本處理，離心取上清后按測定步驟操作，測得A空白=1.037、A對照=0.012、A測定=0.760，根據(jù)計算公式得：

DPPH自由基清除率D% =[[A空白-(A測定-A對照)]÷A空白]×100%=27.9%。

3、 稱取0.05g枸杞加入1mL提取液進(jìn)行樣本處理，離心取上清稀釋20倍后按測定步驟操作，測得A空白=1.037、A對照=0.005、A測定=0.829，根據(jù)計算公式得：

DPPH自由基清除率D% =[[A空白-(A測定-A對照)]÷A空白]×100%=20.5%。

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