質(zhì)粒大量提取試劑盒 solarbio
貨號(hào)：D1110
規(guī)格：10T

保存：常溫保存，復(fù)檢期一年。

產(chǎn)品說(shuō)明：
    本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，通過(guò)吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的特性提取質(zhì)粒DNA。吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。從50-100ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中，可快速提取200-300μg純凈地高拷貝質(zhì)粒DNA，提取率達(dá)85-90％。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)的分子生物學(xué)試驗(yàn)，包括酶切、PCR、測(cè)序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。本試劑盒無(wú)需使用酚等有毒試劑，操作安全。

    使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液Ⅰ在使用
前先加入 RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

操作步驟:
1. 收集 50-100ml 過(guò)一夜培養(yǎng)的菌液 11000rpm 離心 10 分鐘，盡量吸除上清(菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中)。
2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入 5ml 溶液Ⅰ (請(qǐng)先檢查是否已加入 RNaseA) ，使用移液器或渦旋振蕩器*懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。
3. 向離心管中加入 5ml 溶液Ⅱ ，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次使菌體充分裂解。 注意：①翻轉(zhuǎn)一定要溫和，以免污染細(xì)菌基因組 DNA。②作用時(shí)間不要超過(guò) 5 分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。
4. 向離心管中加入 7ml 溶液Ⅲ ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀(如菌液過(guò)多，可在此步放置 5 分鐘，以盡可能的降解 RNA)。11000rpm 離心 10 分鐘，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，注意盡量不要吸出沉淀。
注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。 如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5. 將上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置 2-3 分鐘，11000rpm 離心 30-60 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中(如為提高得率，可將收集管中的液體加入吸附柱再次吸附一次)。
6. 向吸附柱中加入 8ml 漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，11000rpm 離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7. 向吸附柱中加入 6ml 漂洗液，11000rpm 離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8. 11000rpm 離心 5min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影晌后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR 等。
9. 將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 1-2ml 經(jīng) 65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置 5min，11000rpm 離心 2min，收集質(zhì)粒溶液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
10. 為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 5min， 11000rpm 離心 2min。

產(chǎn)品包裝：

注意事項(xiàng)：

1、溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA(將試劑盒中提供的RNaseA全部加入)，混勻，置于2-8℃保存。
2、*次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說(shuō)明在漂洗液中加入無(wú)水乙醇配制成工作液(向15ml的漂洗液中加入60ml的無(wú)水乙醇)。
3、使用前請(qǐng)先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。
4、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子，如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)室溫下進(jìn)行離心。
5、如果是提取革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)粒，必須在裂解細(xì)胞前破細(xì)胞壁，方法如下：收集適量菌體，加入5ml溶液Ⅰ，充分懸浮菌體，加入溶菌酶終濃度為10-20mg/ml，37℃處理30min左右。加入溶菌酶的濃度和處理時(shí)間可根據(jù)不同的菌株和具體試驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整。
6、洗脫緩沖液的體積好不少于1ml，體積過(guò)小會(huì)影響回收效率；洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液
應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)此范圍)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。

 

相關(guān)文獻(xiàn)：

 《A rapid and efficient one-step site-directed deletion, insertion, and substitution mutagenesis protocol》 作者:Deguang Wu，Xuewu Guo，Jun Lu，Xi Sun，F(xiàn)eng Li，Yefu Chen，Dongguang Xiao 期刊:Analytical Biochemistry 影響因子:2.275 PMID:23256925
《Enhanced freeze tolerance of baker’s yeast by overexpressed trehalose-6-phosphate synthase gene (TPS1) and deleted trehalase genes in frozen dough》 作者:Haigang Tan,Jian Dong,Guanglu Wang,Haiyan Xu,Cuiying Zhang,Dongguang Xiao 期刊:Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 影響因子:2.533 PMID:24951963
《A two-step integration method for seamless gene deletion in baker’s yeast》 作者:Jian Dong，Guanglu Wang，Cuiying Zhang，Haigang Tan，Xi Sun，Mingyue Wu，Dongguang Xiao 期刊:Analytical Biochemistry 影響因子:2.275 PMID:23597844

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