一步法 TUNEL  細胞凋亡檢測試劑盒(FITC) 說明書
貨號：CA1040
規(guī)格：25T/50T
保存：-20℃保存，F(xiàn)ITC-dUTP 需避光保存。如果頻繁使用（一周內） ，5×Reaction Buffer，F(xiàn)ITC-dUTP 和抗熒
光淬滅封片劑可 2-8℃保存。
產品簡介：
一步法 TUNEL 細胞凋亡檢測是一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于經(jīng)過固定和洗滌的細
胞或組織，只要經(jīng)過一步染色反應，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測到凋亡細胞。細胞在發(fā)生
凋亡時，會激活一些 DNA 內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組 DNA。細胞凋亡時抽提 DNA 進行電
泳檢測，可以觀察到 180-200bp 的 DNA ladder?；蚪M DNA 斷裂時，暴露的 3’-OH 可以在末端脫氧核苷酸轉
移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上熒光素(FITC)標記的 dUTP(fluorescein-dUTP)，從
而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，這就是 TUNEL(TdT--mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測
細胞凋亡的原理。
本試劑盒有如下優(yōu)點。(1)高靈敏度：可以在單細胞水平檢測到細胞凋亡，同時由于凋亡早期就有 DNA 斷
裂，可以檢測到早期的細胞凋亡。(2)特異性：TUNEL 檢測時通常更容易標記凋亡細胞，而不容易標記壞死細
胞。(3)快速：僅需約 1-2 個小時即可完成。(4)方便：只需一步染色反應，洗滌后即可觀察，不必使用二抗等進
行多步操作。(5)應用范圍廣：可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細胞或
懸浮細胞的凋亡情況。
TUNEL 法特異性檢測細胞凋亡時產生的 DNA 斷裂，但不會檢測出射線等誘導的 DNA 斷裂(和細胞凋亡
時的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區(qū)分開，另一方面也不會把射線等誘導發(fā)生 DNA 斷裂的非
凋亡細胞判斷為凋亡細胞。
極少數(shù)細胞凋亡時沒有 DNA 斷裂， 此時不適用 TUNEL 法檢測。 在個別類型的壞死細胞中也發(fā)現(xiàn) TUNEL
檢測呈陽性。在需要嚴格判斷細胞凋亡的情況下，好同時檢測多個凋亡指標。
產品內容：
試劑名稱 包裝 包裝
TdT 酶 25μl  50μl
FITC-dUTP 25μl 50μl
5×Reaction Buffer 400μl 2×400μl
抗熒光淬滅封片劑  2.5ml 5ml
說明書 1 份  1 份
注意事項：
用戶需自備用于洗滌細胞的PBS或HBSS， 用于固定的4%多聚甲醛， 同時需自備含0.1% Triton X-100的PBS。
如果用于石蠟切片的檢測，需自備蛋白酶K，二甲苯。 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
操作步驟：
1. 對于貼壁細胞或細胞涂片：
a. PBS或HBSS洗滌一次。
b.如果細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。
c.用 4%多聚甲醛固定細胞 30-60 分鐘。
d.用PBS或HBSS洗滌一次。
e.加入含 0.1% Triton X-100 的PBS，冰浴孵育 2 分鐘。
f.轉步驟 5。
2. 對于懸浮細胞或細胞懸液：
a. 收集細胞(不超過 2×10
6 細胞)，PBS或HBSS洗滌一次。
b. 用 4%多聚甲醛固定細胞 30-60 分鐘。為防止細胞聚集成團，宜在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動
的同時進行固定。
c. 用PBS或HBSS洗滌一次。
d. 用含 0.1% Triton X-100 的PBS重懸細胞，冰浴孵育 2 分鐘。
e. 轉步驟 5。
3. 對于石蠟切片：
a. 二甲苯中脫蠟 5-10 分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟 5-10 分鐘。無水乙醇 5 分鐘。90%乙醇 2 分
鐘。70%乙醇 2 分鐘，蒸餾水 2 分鐘。
b. 滴加 20μg/ml不含DNase的蛋白酶K， 20-37℃作用 15-30 分鐘(不同組織的適宜作用溫度和時間需自
行摸索)。
c. PBS或HBSS洗滌 3 次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續(xù)的標記反應。
d. 轉步驟 5。
4. 對于冷凍切片：
a. 用 4%多聚甲醛固定細胞 30-60 分鐘。
b. PBS或HBSS洗滌 2 次，每次 10 分鐘。
c. 加入含 0.1% Triton X-100 的PBS，冰浴孵育 2 分鐘。
d. 轉步驟 5。
5. 配制TUNEL檢測液：
參考下表配制適當量的TUNEL檢測液，需充分混勻。注意：配制好的TUNEL檢測液必須一次使用完
畢，不能凍存。陰性對照不加TdT酶，其余相同。
1 個樣品 5 個樣品 10 個樣品
TdT酶 1μl  5μl 10μl
FITC-dUTP  1μl  5μl 10μl
5×Reaction Buffer 10μl 50μl 100μl
ddH2O 38μl  190μl 380μl
總體積 50μl 250μl  500μl
6. 對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片：
a. 用PBS或HBSS洗滌 2 次。
b. 在樣品上加 50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育 60 分鐘。注意：孵育時需注意在周圍用浸足水的
紙或藥棉等保持濕潤，以盡量減少TUNEL檢測液的蒸發(fā)?；蛘咧脻窈兄?。
c. PBS或HBSS洗滌 3 次。
d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長范圍為 450-500nm，發(fā)射波
長范圍為 515-565nm(綠色熒光)。
7. 對于懸浮細胞或細胞懸液：
a. 用PBS或HBSS洗滌 2 次。
b. 加入 50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育 30-60 分鐘。
c. PBS或HBSS洗滌 2 次。
d. 用 250-500μl PBS或HBSS懸浮。
e. 此時可以用流式細胞儀進行檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察?？梢允褂玫募ぐl(fā)波長范圍為
450-500nm，發(fā)射波長范圍為 515-565nm(綠色熒光)。
常見問題：
1. 出現(xiàn)非特異性熒光標記。
a. 有些細胞或組織，例如平滑肌細胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導致出現(xiàn)
非特異性的熒光標記。解決方法是，取細胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導致假陽性。
b. 使用了不適當?shù)墓潭ㄒ?，例如一些酸性固定液，導致出現(xiàn)假陽性。建議采用推薦的固定液。
c. TUNEL檢測反應時間過長， 或TUNEL檢測反應過程中反應液滲漏， 細胞或組織表面不能保持濕潤，
也可能出現(xiàn)非特異性熒光。注意控制反應時間，并確保TUNEL檢測反應液能很好地覆蓋樣品。
2. 熒光背景很高。
a. 支原體污染。請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。
b. 高速分裂和增殖的細胞，有時也會出現(xiàn)細胞核中的DNA斷裂。
c. TUNEL反應過強?？梢杂秒p蒸水稀釋TdT酶 2-5 倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當時使
用。
d. 紅細胞中血紅蛋白導致的自發(fā)熒光產生嚴重干擾。此時宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒。
3. 標記效率低。
a. 使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。
b. 固定時間過長，導致交聯(lián)程度過高。此時宜減少固定時間。
c. 熒光淬滅。Fluorescence在普通光照 10 分鐘就會嚴重淬滅，解決方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶雙染時，如果碘化丙啶染色過深會導致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化
丙啶可以接受fluorescein激發(fā)產生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如
0.5 微克/毫升碘化丙啶。
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