丙酮酸激酶(PK)活性檢測試劑盒 其他系列

貨號：BC0540

規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡介 ：
    PK（EC 2.7.1.40）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化糖酵解過程中的后一步反應(yīng)，是糖酵解過程中的主要限速酶之一，也是產(chǎn)生 ATP 的關(guān)鍵酶之一，因此測定 PK 活性具有重要意義。
    PK 催化磷酸烯醇式丙酮酸和 ADP 生成 ATP 和丙酮酸， 乳酸脫氫酶進一步催化 NADH 和丙酮酸生成乳酸和 NAD + ，在 340nm 下測定 NADH 下降速率，即可反映 PK 活性。
試驗中所需的儀器和試劑：
    紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

產(chǎn)品內(nèi)容 ：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 15 mL×3 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×3 支，-20℃保存；
試劑三：粉劑×3 支，-20℃保存；
試劑四：粉劑×3 支，-20℃保存；臨用前每支加入 500µL 雙蒸水充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存；
試劑五：液體×3 支，4℃保存；臨用前每支加入 300µL 雙蒸水充分溶解備用，用不完的試劑仍 4℃保存；
PK 工作液的配制：取試劑一、試劑二和試劑三各一支，將試劑二和試劑三依次轉(zhuǎn)移試劑一中，充分溶解待用，這樣可以分三批測定，防止試劑失效。

操作步驟 ：
一 、 樣品 的前處理 ：
(1) 細(xì)菌或細(xì)胞處理：
收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 200 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 400µL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 200W，工作 3s，間歇 10s，工作 35 次），8000g，4℃，離心 10min，取上清，置冰上待測。
(2) 組織處理：
稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿；8000g ，4℃，離心 10min，取上清，置冰上待測。
(3) 血清(漿)樣品：直接檢測
二 、 測定操作表 ：
試劑名稱（µL）  測定管
PK 工作液  900
試劑四 30
試劑五  15
充分混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）水浴 5 分鐘
樣本  30
將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，加樣本的同時開始計時，在 340nm 波長下記錄 20 秒時的初始吸光度 A1，比色后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴中準(zhǔn)確反應(yīng) 2 分鐘； 迅速取出比色皿并擦干， 340 nm 下比色， 記錄 2 分 20 秒時的吸光度 A2， 計算A=A1-A2。

注意事項 ：
1、 測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。
2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持 37℃或 25℃，取小燒杯一只裝入一定量的 37℃或 25℃蒸餾水，將此燒杯放入 37℃或 25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
3、好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

PK活單位的計算 ：
1 、 血清 （ 漿 ）PK  活力的計算:
單位定義：每升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1 µmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

計算公式：
PK（U/L）=反應(yīng)總體積（975µL）÷樣本體積（30µL）÷反應(yīng)時間(2min)÷NADH 消光系數(shù)（6.22×10 -3 ）×?A=2613 ×?A
2 、 組織中 PK  活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
PK（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（975µL）÷樣本體積（30µL）÷反應(yīng)時間(2min)÷NADH 消光系數(shù)（6.22×10 -3 ）×?A÷蛋白濃度（mg/mL）=2613×?A ÷蛋白濃度（mg/mL）
(2)按樣本鮮重計算
單位定義：每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
PK（U/g 鮮重）=反應(yīng)總體積（975µL）÷樣本體積（30µL）÷反應(yīng)時間(2min)÷NADH 消光系數(shù)（6.22×10 -3 ）×?A ÷樣本鮮重（g/mL）=2613× ?A ÷樣本鮮重（g/mL）

3 、 細(xì)菌或細(xì)胞中 PK  活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
PK（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（975µL）÷樣本體積（30µL）÷反應(yīng)時間(2min)÷NADH 消光系數(shù)（6.22×10 -3 ）×?A÷蛋白濃度（mg/mL）=2613×?A ÷蛋白濃度（mg/mL）
(2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
PK（U/10 4 cell）=反應(yīng)總體積（975µL）÷樣本體積（30µL）÷反應(yīng)時間(2min)÷NADH 消光系數(shù)（6.22×10 -3 ）×?A ÷細(xì)菌或細(xì)胞密度（10 4 /mL）=2613×?A ÷細(xì)菌或細(xì)胞密度（10 4 /mL）

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