脫氫抗壞血酸還原酶活性測(cè)定試劑盒 維生素C

測(cè)定意義：
    DHAR 存在于線粒體、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中。DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA，調(diào)控細(xì)胞 AsA/DHA 比值，是抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶。提高植物體內(nèi)的DHAR 活性，可提高植物食品中 AsA 含量，進(jìn)而提高植物食品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

測(cè)定原理：
    DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA， 通過測(cè)定 DHA 被還原量可計(jì)算得 DHAR 活性。

實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備：
研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1ml 石英比色皿、可調(diào)式移液器、雙蒸水。

試劑組成和配制：

試劑一×1 瓶，稀釋液一×1 支，臨用前配制，取少量雙蒸水充分溶解試劑一后，加稀釋液一
0.381ml，再繼續(xù)加雙蒸水定容 50ml ；
試劑二×1 瓶，加 50ml 雙蒸水充分溶解；
試劑三×1 支，臨用前加 5.5ml 雙蒸水充分溶解；
試劑四×1 瓶，臨用前加雙蒸水 5.5ml 充分溶解。

樣品前處理：
    稱取約 0.1g 樣品，加試劑一 1ml，冰上充分研磨，16000g 4℃離心 20min，取上清。

DHAR 測(cè)定操作：

按下表操作：

迅速混勻后，于 265nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值，空白管和測(cè)定管吸光值分別記為
A1、A2 和 A3、A4。

DHAR 活性計(jì)算：
     DHAR 活力單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1μmol AsA 為 1U。
計(jì)算公式：DHAR(U/mg prot)= △A265/min×[10 6 /(ε•d)]×(V 總/V 樣)/Cpr
= [(A4-A3)-(A2-A1)÷2]×[10 6 ÷(5.42×10 4 ×1)]×(1/0.1)÷Cpr
=92.25×[(A4-A3)-(A2-A1)]÷Cpr；
    △A265/min =(△A 測(cè)定管-△A 空白管)/2，即每分鐘吸光值變化；ε :產(chǎn)物在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×10 4 mol/L • cm，106：摩爾分子換算成微摩爾分子；d：比色杯光徑（cm） ；V 總：反應(yīng)總體積（ml） ，V 樣：所用樣品體積（ml） ；Cpr：蛋白濃度（mg/ml） 。

注意事項(xiàng):

試劑一、試劑三和試劑四均需臨用前配制。
樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力。
稀釋液一有揮發(fā)性和刺激性，吸取時(shí)好戴手套和口罩，好用移液管吸取。

脫氫抗壞血酸還原酶活性測(cè)定試劑盒 維生素C