硫氧還蛋白氧化還原酶（TrxR）測(cè)試盒輔酶系

硫氧還蛋白還原酶（TrxR）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
可見(jiàn)分光光度法

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
貨號(hào)：BC1150
規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：
試劑一：液體 90mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 5 mL 蒸餾水溶解。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 5 mL 蒸餾水溶解。
試劑四：液體×1 支，-20℃避光保存。

產(chǎn)品說(shuō)明：
TrxR 是一種 NADPH 依賴的包含 FAD 結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，與硫氧還蛋白以及 NADPH 共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)。TrxR 與 GR 活性類似，催化 GSSG 還原生成 GSH，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。TrxR 催化 NADPH 還原 DTNB 生成 TNB 和 NADP+，TNB 在 412 nm 有特征吸收峰，但還原型谷胱甘肽與 DTNB 同樣能反應(yīng)生成 TNB，因此本試劑盒利用 2-乙烯吡啶抑制樣品中原有的還原型谷胱甘肽，通過(guò)測(cè)定 412nm 波長(zhǎng)處 TNB 的增加速率，即可計(jì)算 TrxR 活性。

自備儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、可調(diào)節(jié)移液器、研缽/勻漿器、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

操作步驟：
一、粗酶液提?。?br />1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。10000rpm，4℃離心10min，取上清置冰上待檢測(cè)。
2. 細(xì)菌、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3s，間隔7s，總時(shí)間3min），然后10000rpm，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 測(cè)定前將上清液與試劑四以50：1的體積比混勻（即取100µL上清液加入2µL試劑四混合）37℃水浴30min后冰上。

二、TrxR 測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 后，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 412nm，用蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一在 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動(dòng)物）預(yù)熱 30min。
3. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100µL 試劑二，100µL 試劑三，800µL 試劑一，迅速混勻后于 412 nm 測(cè)定 10 s 時(shí)吸光度，然后將比色皿放入 37℃水浴 5min 后混勻立即測(cè)定 310 s 吸光度，記為 A1 和 A2?！鰽 空白管=A2-A1。
4. 測(cè)定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100µL 試劑二，100µL 試劑三，700µL 試劑一，100µL 上清液，迅速混勻后于 412 nm 測(cè)定 10 s 時(shí)吸光度，然后將比色皿放入 37℃水浴 5min 后混勻立即測(cè)定 310s吸光度，記為 A3 和 A4?！鰽 測(cè)定管=A4-A3。

三、TrxR 活性計(jì)算：
（1）按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘生成 1nmol TNB 為一個(gè)酶活力單位。

TrxR（U/mg prot）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反總×109÷(Cpr×V 樣)÷T
=147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每克樣品每分鐘生成 1nmol TNB 為一個(gè)酶活力單位。
TrxR（U/g 鮮重）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反總×109÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T
=147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：在25℃或者37℃中，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘生成1nmol TNB為一個(gè)酶活力單位。
TrxR（U/104 cell）=（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反總×109÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 147×（△A 測(cè)定管-△A 空白管）÷細(xì)胞數(shù)量

ε：TNB 在 412nm 處的摩爾消光系數(shù)，1.36 ×104 L/ mol/cm；
d：比色皿光徑，1cm；
V 反總：反應(yīng)體系總體積，1000µL=0.001L；
Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；
V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100µL=0.1 mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；
W：樣品鮮重，g；
V 樣總：提取液體積，1mL；
細(xì)胞數(shù)量：以 104為單位，萬(wàn)個(gè)。

注意事項(xiàng)：
1、哺乳動(dòng)物組織及血液制品 TrxR 活力測(cè)定時(shí)，一般須用蒸餾水稀釋 5 倍左右；測(cè)定過(guò)程操作須迅速。
2、由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約 0.1mg/mL），所以在測(cè)定樣品蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量。

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