喹諾酮類快速檢測試劑盒說明書
一、原理
喹諾酮類快速檢測試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物喹諾酮類藥物和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗喹諾酮類藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留喹諾酮類藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物喹諾酮類藥物的含量。
二、試劑盒特性 |
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u | 試劑盒靈敏度： | 1ppb |
u | 孵育溫度： | 25℃ |
u | 孵育時間： | 30min～15min |
u | 樣本檢測下限 |
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恩諾沙星（ENR）檢測下限 ———— 1ppb
環(huán)丙沙星（CIF）檢測下限 | ————約 1ppb | ||
氧氟沙星（OFL）檢測下限 | ———— | 約 1ppb | |
達氟沙星（DAN）檢測下限 | ———— 約 1ppb | ||
諾氟沙星（NOR）檢測下限 | ————約 0.5 ppb | ||
洛美沙星（LOM）檢測下限 | ———— 約 1ppb | ||
培氟沙星（PEF）檢測下限 | ———— | 約 0.5ppb | |
依諾沙星（ENO）檢測下限 | ·————約 1ppb | ||
奧索利酸（OXO）檢測下限 | ————約 1ppb | ||
氟喹酸 （FLU）檢測下限 | ———— 約 1ppb | ||
麻保沙星（MAR）檢測下限 | ———— 約 1ppb | ||
氨氟沙星（AMI）檢測下限 | ————約 1ppb | ||
那氟沙星（NAD）檢測下限 | ———— | 約 2ppb | |
u 交叉反應(yīng)率 |
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恩諾沙星（ENR） | —————— | 100% | |
環(huán)丙沙星（CIF） | ·—————— | 92.88% | |
氧氟沙星（OFL） | —————— | 98.86% | |
奧索利酸（OXO） ———— | 116.86% | ||
達氟沙星（DAN） - | 102.63% | |
諾氟沙星（NOR） ··························· | 148.65% | |
洛美沙星（LOM） ·························· | 86.24% | |
培氟沙星（PEF） | ·························· | 156.60% |
依諾沙星（ENO） ··························· | 98.97% | |
氟喹酸（FLU） | —————— | 96.73% |
麻保沙星（MAR） —————— 110.63% | ||
氨氟沙星（AMI） —————— | 98.86% | |
那氟沙星（NAD） —————— | 56.81% | |
- 樣本回收率
組 | 織 ———————— | 80±15% | ||
血 | 清 ———————— | 80±15% | ||
蜂 | 蜜 ———————— | 75±15% | ||
三、試劑盒組成 |
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1 | 微量測試孔 | 每條 8 孔，一板 12 條 | ||
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| 標(biāo)準(zhǔn)液×6 瓶 | 0ppb |
| 1ppb |
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2 | 3ppb |
| 9ppb | |
（1ml/瓶） |
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| 27ppb |
| 81ppb | |
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3 | 酶標(biāo)記物 | 7ml |
| 紅色帽 |
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4 | 抗體工作液 | 7ml |
| 藍色帽 |
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5 | 底物 A 液 | 7ml |
| 白色帽 |
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6 | 底物 B 液 | 7ml |
| 黑色帽 |
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7 | 終止液 | 7ml |
| 黃色帽 |
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8 | 20X 濃縮洗滌液 | 40ml |
| 白色帽 |
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9 | 2X 濃縮復(fù)溶液 | 50ml |
| 透明帽 |
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四、所用儀器、試劑
具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）
微量移液器：單道 20～200ul、單道 100～1000ul、多道 250 ul
試 劑：濃鹽酸、二氯甲烷、正己烷、乙腈、
肝素鈉、Na2HPO4·12H2O、 NaH2PO4·2H2O
五、樣本前處理步驟
- 樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。
（b）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
樣本前處理需配制：
配液 1 0.1M HCL 溶液：
860µl 濃鹽酸加去離子水 100ml 溶解。
配液 2 乙腈-二氯甲烷混合溶液：
V 乙腈：V 二氯甲烷 = 1 : 4
配液 3 pH7.2 0.02M PB 緩沖液：
5.16g Na2HPO4·12H2O + 0.87g NaH2PO4·2H2O
加去離子水 1L 溶解。
配液 4 乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl 混合溶液
100ml乙腈-二氯甲烷(V乙腈：V二氯甲烷 = 4 :1）
混合溶液中加入 5ml 0.1M HCl 溶液。
配液 5 用去離子水將 2X 濃縮復(fù)溶液按 1：1 稀釋
（1 份濃縮復(fù)溶液+1 份去離子水）用于樣本復(fù)溶。
（a）組織樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等）
1、稱 2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于 50ml 離心
管中；2、加入乙腈-二氯甲烷混合溶液 8ml，振蕩 5min，4000r/min 以上，15℃離心 10min；3、取 4ml 有機相至干燥容器中，56℃氮氣吹干/旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；4、用 1ml 稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷 1ml 混合 30s，4000r/min 以上，15℃離心 5min；
5、去除上層取下層 50µl 液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1
（b）血清樣本的處理
1、用加有肝素鈉（20-30 單位/ml 血）的離心管采集雞血樣本（建議采血注射器也用肝素鈉潤洗），血樣本室溫靜置 1h，待析出血漿后 4000r/min 以上，15℃離心 10min，取出血漿 1ml；
2、加入乙腈（無水）4ml 上下充分混合 5min， 4000r/min 以上，15℃離心 10min；
3、移上清至另一離心管中，加入 2ml 0.02M PB 緩沖液，混勻；
4、加入二氯甲烷 5ml，充分混勻 5min，4000r/min，
15℃離心 10min，去上層，取下層有機相到干燥瓶中（清亮無雜質(zhì)），50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干/氮氣吹干；
5、用 1ml 稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷 1ml 混合 30s，4000r/min 以上，15℃離心 5min；
6、輕吸掉上層和中間白色雜質(zhì)，取下層相 100µl加入 100µl 稀釋后的復(fù)溶液，混合 30s；7、取 50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：2
（c）蜂蜜樣本處理方法：
1、取 2.0±0.05g 蜂蜜樣本于 50ml 離心管中；加入 8ml 乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl 混合溶液， 充分振蕩 3min，15℃ 4000r/min 以上離心 10min；
2、取 2ml 上清液于 56℃氮氣或空氣流吹干；
3、加入 1ml 的樣本復(fù)溶液，充分震蕩 1min；
4、取 50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 2 倍
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
測定前應(yīng)須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2-8℃。
3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
操作步驟：
5、將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡 30min 以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
6、按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于 2-8℃，不要冷凍。
7、配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
8、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均需做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔的樣本孔所在的位置。
9、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物 50 μl/孔，再加入抗體工作液 50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng) 30min。
10、 用洗滌液按每孔 250μl 洗板 4-5 次，每次浸泡 15-30 秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
11、 顯色：每孔加入底物 A 液 50µl 再加入底物 B 液 50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。12、 測定：每孔加入終止液 50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長450/630nm 檢測，在 5min 內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD 值）。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含喹諾酮類藥物量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為0.238， 樣本 2 的吸光度值為 0.946，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb 為 1.845； 1ppb 為 1.542；3ppb
1.130； 9ppb 為 0.635；27ppb 為 0.326； 81ppb0.156。則樣本 1 的濃度范圍是 27ppb - 81ppb；
樣本 2 的濃度范圍是 3ppb - 9ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物的實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以 100%，即
B百分吸光率（%）＝ ×100%
B0
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品
濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。
八、 注意事項
1、 室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫
（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的喹諾酮類快速檢測試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒理想反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
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