類器官（Organoid）是十四五國家重點研發(fā)計劃中6個重點專項之一，是國家科技部的重點關注項目。近年來相關的項目和文章也迅速升溫，僅過去的2023年上半年，“Organoid"相關文章就有兩千多篇，遠超前幾年同期水平，意味著該領域的研究熱度持續(xù)上升。
國自然基金申報 “內(nèi)卷"趨勢越來越顯著，而類器官（Organoid）作為前沿熱點技術之一，近年來備受申請人和評審專家們的關注。類器官相關的課題和項目在申請國自然上具有得天獨厚的優(yōu)勢。尤其是2018年以來，類器官相關方向，連續(xù)幾年被國自然申報指南列為推薦項目的研究方向。作為具有高適用度的體外模型之一，類器官從最初的體外模型補充參考的工具，逐漸開始“挑國自然大梁"。
PubMed類器官相關文章數(shù)量趨勢
近期，一篇以《人腦類器官中的譜系記錄》（Lineage recording in human cerebral organoids）為題的類器官文獻登上Nature Methods。該文獻結合單細胞測序、空間轉(zhuǎn)錄組以及4D光片顯微成像技術（長時間高分辨類器官光片顯微鏡），實現(xiàn)了人類大腦類器官的譜系記錄。
近年來，人類誘導多能干細胞iPSCs衍生的類器官，為研究人體器官發(fā)育提供了模型。單細胞測序技術能夠高度鑒定系統(tǒng)內(nèi)細胞狀態(tài)的描述，然而，目前還沒有很好的方法直接測量細胞譜系關系。譜系偶聯(lián)scRNA-seq允許在復雜組織和其他細胞分化場景中更好地注釋細胞命運規(guī)范和軌跡推斷。長時間高分辨類器官光片顯微鏡基于圖像的方法，為捕捉全面的發(fā)育動態(tài)提供了一種可視化方法。因此，譜系偶聯(lián)單細胞轉(zhuǎn)錄組學和長時間高分辨類器官光片顯微鏡為記錄和理解iPSCs建立的類器官系統(tǒng)的譜系動力學提供了全面的解決方案。
長時間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2是一款全新光片成像平臺，可實現(xiàn)活細胞的長時間、高分辨、高通量、多樣品同時成像，非常適合對直徑達300 μm的光敏樣品（如卵母細胞，胚胎和類器官）進行長期實時高時空分辨率和低光毒性的觀察與成像。這一成熟的長時間實時類器官成像技術也為本實驗提供了關鍵數(shù)據(jù)支撐。
作者建立了一個雙通道細胞譜系記錄系統(tǒng)(iTracer) 來了解腦類器官腦區(qū)域化過程中的譜系動力學。系統(tǒng)設置從最原始的iPSCs樣本庫中開始跟蹤克隆，同時也允許使用誘導疤痕在不同的時間點進行譜系記錄，以解決動力學與神經(jīng)元命運之間建立關系尚不明確的問題。該系統(tǒng)既可以進行克隆分析，也可以探索細胞命運建立的時間動態(tài)，避免了多輪標記。在腦類器官發(fā)育的時間過程中進行的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析證實，在單個類器官中形成了不同的腦區(qū)域，類器官中的腦區(qū)域特征與發(fā)育中的小鼠大腦空間原位地圖集的對應區(qū)域非常相似。使用iTracer來探索在腦類器官模式和神經(jīng)發(fā)生過程中與分子特征相結合的譜系，并表明該系統(tǒng)與空間轉(zhuǎn)錄組學兼容。
圖1 iTracer Sleeping Beauty示意圖并且揭示了人類大腦類器官細胞命運的克隆性
為了將分子狀態(tài)、細胞譜系和位置信息聯(lián)系起來，作者建立了“空間iTracer"，它使用空間轉(zhuǎn)錄組測序技術來測量基因表達和iTracer讀取結果。數(shù)據(jù)表明，在腦類器官發(fā)育過程中，相關細胞傾向于聚集在類器官的同一區(qū)域，接收相似的圖案信號，因此平均而言被限制在相同的大腦區(qū)域身份中。iTracer和空間iTracer共同揭示了腦類器官不同腦區(qū)細胞克隆的富集，這可以追溯到初始化EB 內(nèi)的克隆。
圖2 空間iTracer連接腦類器官的譜系、分子狀態(tài)和位置信息
為了直接測量神經(jīng)外胚層到神經(jīng)上皮階段發(fā)育中的類器官的譜系動力學和克隆的空間積累，作者使用4D光片顯微成像技術（長時間高分辨類器官光片顯微鏡）建立了發(fā)育中的腦類器官的長期實時成像(圖3a)。簡單地說，作者生成了含有5% iPSCs的類器官，其細胞核被FUS-mEGFP熒光報告標記，將EB嵌入成像室的Matrigel中，并在神經(jīng)誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，類器官使用Viventis Microscopy開發(fā)的LS1 Live光片顯微鏡成像，使用X25物鏡，每2 μm獲得連續(xù)z步，共150步。采集幀率為30分鐘，總共100小時(200幀)用于跟蹤。并跟蹤發(fā)育 65-100小時(圖3b)。隨著EB的生長和發(fā)育，觀察到幾個管腔的形成，每個管腔都可以在三維上跟蹤(圖3c)。
圖3 腦類器官發(fā)育的長時間高分辨類器官光片顯微鏡4D成像
在整個記錄時間內(nèi)，作者使用Mastodon直接跟蹤單個細胞核的譜系，這是一個允許在大型4D數(shù)據(jù)集中半自動跟蹤和管理細胞核譜系的方案(圖3d,e)。他可視化了源自原始細胞核的子細胞的空間分布，稱之為譜系1 (L1)，并生成了100小時增殖后的譜系樹(圖3f)。一個細胞周期的平均持續(xù)時間估計為17.3小時。作者觀察到，在整個記錄時間內(nèi)，L1仍然局限于腔內(nèi)的同一區(qū)域(圖3d)。跟蹤了另外三個核，其中兩個核與L1 (L2-L3)在相同的管腔區(qū)域相鄰，第三個核(L4)位于EB中一個截然相反的未來管腔區(qū)域(圖3g)。作者量化了每個樹之間的空間距離，并檢查了類器官3D空間內(nèi)所有子細胞的分布(圖3g-i)。在65小時的過程中，初始化細胞核平均產(chǎn)生13個后代細胞核，它們都填充在擴大的類器官中，但在空間上仍然局限于親本管腔，表現(xiàn)出有限的遠離其譜系成員的遷移(圖3g-i)。這些結果表明，克隆的早期空間排列隨后的局部擴增導致腦區(qū)域的不同譜系組成，這證實了之前基于iTracer的類器官腦區(qū)域克隆性觀察(圖3j)。
腦類器官發(fā)育的長時間高分辨類器官光片成像視頻
另外，作者還使用iTracer來確定細胞在腦類器官發(fā)育過程中何時限制了它們的命運。研究者使用譜系記錄器的兩個通道(在EB初始化和發(fā)育過程中誘導的疤痕中引入的條形碼)以及單細胞轉(zhuǎn)錄組來構建命運映射的全類器官系統(tǒng)發(fā)育。使用iTracer以高分辨率評估不同腦類器官區(qū)域中祖細胞到神經(jīng)元譜系的可變性。為了實現(xiàn)深層譜系采樣，他們對200 μm iTracer類器官切片的兩個微解剖外周區(qū)域進行了譜系偶聯(lián)單細胞轉(zhuǎn)錄組學。
作者整合了靜態(tài)序列標記和基于CRISPR 技術的動態(tài)序列標記，可用于標記起始時間點的不同干細胞，也包括基于 CRISPR 編輯系統(tǒng)的動態(tài)序列標記，結合帶有可誘導 Cas9 蛋白基因的干細胞，即可在特定時間點產(chǎn)生額外的隨機突變，從而得到第二層細胞譜系信息。通過使用4D光片顯微成像技術（長時間高分辨類器官光片顯微鏡），對稀疏核標記的大腦類器官進行追蹤觀察。而在此基礎上，通過在不同時間點引入動態(tài)序列標記，還可得到大腦類器官中不同細胞類型、特別是不同類型神經(jīng)元的命運決定關鍵時間點，并對同一多能干細胞產(chǎn)生的不同后代神經(jīng)元的分化情況進行比較。進而得出在分裂分化過程中，大腦類器官的細胞并未發(fā)生顯著的細胞遷移，因而其后代細胞呈聚集分布，并在類似的微環(huán)境作用下，被誘導為同樣類型的神經(jīng)元。
未來，iTracer以及4D光片顯微成像技術（長時間高分辨類器官光片顯微鏡）的聯(lián)合應用將成為了解人類類器官系統(tǒng)發(fā)育障礙背后的突變影響的有力方法。
參考文獻：
[1]. He et al., Lineage recording in human cerebral organoids. Nature Methods
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