【背景概述】

CHO細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary cells）是一種來(lái)自中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的細(xì)胞系，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比具有高蛋白產(chǎn)量、抵抗許多人類病毒感染、適合大規(guī)模工業(yè)培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)。早期研究表明，非糖基化版本的Avelumab(一種FDA批準(zhǔn)的抗PD-L1抗體)在體內(nèi)表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗腫瘤活性。因此，創(chuàng)建一個(gè)敲除非人類糖基化途徑相關(guān)基因的CHO細(xì)胞系具有非常高的商業(yè)利益。但在商業(yè)生產(chǎn)中為確保藥品的同質(zhì)性，監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求CHO細(xì)胞必須是單細(xì)胞來(lái)源的。目前，單克隆細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)方法需要更長(zhǎng)的時(shí)間線和費(fèi)力的工作流程等問(wèn)題。本文作者團(tuán)隊(duì)提出了基因編輯的創(chuàng)新方法，一種結(jié)合CRISPR/Cas9和多功能單細(xì)胞顯微操作技術(shù)- FluidFM的單細(xì)胞核內(nèi)納米注射的方法，以解決當(dāng)前轉(zhuǎn)染方法的一些缺點(diǎn)。FluidFM技術(shù)保證了單克隆性的起源為單個(gè)細(xì)胞，而且避免了繁瑣費(fèi)時(shí)的有限稀釋法、復(fù)雜的單細(xì)胞分選技術(shù)。此外，該方法兼容于在CHO細(xì)胞中開發(fā)單個(gè)敲除克隆或者多個(gè)敲除克隆(FUT8、BAX和DHFR)。對(duì)單個(gè)和多個(gè)敲除克隆的進(jìn)一步分析證實(shí)了靶向基因破壞和蛋白質(zhì)表達(dá)改變。敲除的CHO-K1克隆在隨后的傳代中表現(xiàn)出基因編輯的持久性，與無(wú)血清化學(xué)定義的培養(yǎng)基兼容，并表現(xiàn)出與親本克隆相同的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此外，F(xiàn)luidFM的力學(xué)控制特性避免了傳統(tǒng)電穿孔后觀察到的高細(xì)胞毒性，尤其是在難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中也是有效的。

圖1. FluidFM單細(xì)胞注射技術(shù)基因編輯示意圖

【實(shí)驗(yàn)方法】

單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM OMNIUM納米注射構(gòu)建單克隆敲除CHO-K1細(xì)胞系

第0天，使用多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)-FluidFM OMNIUM將單個(gè) CHO-K1細(xì)胞接種到孔板中心，并記錄單克隆性(圖2A)。第1天，使用FluidFM OMNIUM單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)將含有靶向的FUT8、BAX和DHFR的gRNA/Cas9 RNP復(fù)合物(20 ng µl^?1)注射到單細(xì)胞細(xì)胞核中(圖2B)。12. 5%的gRNA用Atto550標(biāo)記以監(jiān)測(cè)注射效率。注射24小時(shí)后，依舊使用FluidFM OMNIUM單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像，通過(guò)GFP熒光成像檢測(cè)注射效率和存活率(圖2C)。將注射后的細(xì)胞在37℃，5% CO₂(v/v)的細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆擴(kuò)增情況(圖 2D)。14天后，收集克隆，建立生物庫(kù)(圖2E & 2F)。同時(shí)，通過(guò)從目標(biāo)位點(diǎn)擴(kuò)增的PCR片段的Sanger測(cè)序?qū)寺∵M(jìn)行分析。通過(guò)western blot (WB)在蛋白水平上驗(yàn)證了編輯的有效性。

圖2.  (A)將單細(xì)胞接種在12孔板的中心，并記錄單克隆性。(B)接種細(xì)胞12-24小時(shí)后，細(xì)胞核內(nèi)同時(shí)注射Atto550標(biāo)記的RNP靶向BAX、DHER或FUT8或所有三個(gè)基因和GFPmRNA。注入成功與否由核Atto550信號(hào)監(jiān)測(cè)。(C) ) 注射24 h后注射效率和細(xì)胞存活率進(jìn)行明場(chǎng)（左）和GFP熒光（右）監(jiān)測(cè)。(D)在10-12天的過(guò)程中，通過(guò)明場(chǎng)成像記錄的克隆擴(kuò)增情況。

【結(jié)果展示】

在本研究中，作者選擇了三個(gè)已建立的基因靶點(diǎn)(FUT8、BAX 和DHFR)，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因工程，這與改善 CHO表達(dá)系統(tǒng)直接相關(guān)。早期的研究表明，與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是在元代細(xì)胞和傳代細(xì)胞中誘導(dǎo)所需基因修飾的強(qiáng)大工具。

接下來(lái)的目標(biāo)是得到含有FUT8、BAX和DHFR的單一KO單克隆CHO-K1細(xì)胞系或者含有這三種KO的多重KO的目標(biāo)。為了確保重組生物制劑的同質(zhì)性，F(xiàn)DA當(dāng)局要求使用來(lái)自單一克隆的CHO細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)。穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞系的開發(fā)主要是通過(guò)繁瑣復(fù)雜的工作流程進(jìn)行的，如有限稀釋、 克隆細(xì)胞挑選、細(xì)胞分選或陽(yáng)性選擇。此外，這一過(guò)程需要更長(zhǎng)的時(shí)間(>10周)、大工作量的克隆篩選和較低的成功率。為了克服這些限制，本文利用CRISPR/Cas9結(jié)合FluidFM OMNIUM單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)來(lái)加速基因工程單克隆CHO細(xì)胞系的產(chǎn)生。

本文方法從單個(gè)細(xì)胞開始，可以將CRISPR組分直接遞送到單個(gè)CHO-K1細(xì)胞的細(xì)胞核中(圖2)。與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法相比，該方法的主要優(yōu)點(diǎn)包括溫和地遞送，對(duì)遞送到細(xì)胞的RNP的比例和定量開創(chuàng)性的具有可控性。這將最大限度地實(shí)現(xiàn)靶上編輯，并實(shí)現(xiàn)多重編輯。此外，通過(guò)從單個(gè)細(xì)胞開始流程，確保了FDA要求的“單細(xì)胞性"。

本文研究小組使用單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM OMNIUM將靶向FUT8、BAX和DHFR的gRNA/Cas9 RNP復(fù)合物注入單細(xì)胞中，并直達(dá)細(xì)胞核。產(chǎn)生單個(gè)KO或多個(gè)KO。細(xì)胞的單克隆性通過(guò)孔掃描和成像得到驗(yàn)證(圖3A)。注射后第14天的遺傳分析顯示，使用 FluidFM單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)的工作流程，作者獲得了三個(gè)目標(biāo)基因KO的克隆，以及7個(gè)、2個(gè)和1個(gè)分別缺失BAX、DHFR和FUT8的克隆。通過(guò)將Sanger與基因組靶位點(diǎn)比對(duì)來(lái)分析編輯結(jié)果(圖3A，單KO和圖3B 3KO 實(shí)驗(yàn))。然后，又對(duì)選擇的單克隆進(jìn)行蛋白質(zhì)分析，在蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證KO，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)克隆與遺傳數(shù)據(jù)一致(圖3C)。

圖3. FUT8、BAX和DHFR敲除后的單克隆CHO-K1細(xì)胞系的發(fā)育。 (A)野生型對(duì)照(Wt)和基因編輯的CHO-K1細(xì)胞系單敲除(KO)與FUT8(上)、 BAX(中)和DHFR(下)基因組序列的Sanger測(cè)序比對(duì)的代表性圖像。 (B)野生型對(duì)照(Wt)和基因編輯的CHO-K1細(xì)胞系的Sanger測(cè)序比對(duì)圖像， 多重敲除(KO) FUT8(上)、 BAX(中)和DHFR(下)的基因組序列。 (C) Western blot顯示所選克隆的FUT8(左)、 BAX(中)和DHFR(右)檢測(cè)。 以GAPDH作為上樣對(duì)照。 (D) DsRed在親本野生型CHO-K1和多個(gè)KO CHO-K1單克隆細(xì)胞系中與未轉(zhuǎn)染的野生型CHO-K1細(xì)胞的表達(dá)分析。

除了內(nèi)源性靶基因(FUT8、BAX和DHFR)表達(dá)外，所有生成的基因KO克隆(單個(gè)或多個(gè))都表現(xiàn)出與WT CHOK1細(xì)胞相似的細(xì)胞生長(zhǎng)水平和微觀形態(tài)。為了確?；蚪M工程細(xì)胞仍然適合作為表達(dá)宿主，用DsRed mRNA轉(zhuǎn)染3x KO CHO-K1單克隆細(xì)胞系。隨后流式細(xì)胞術(shù)比較轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DsRed表達(dá)水平與親代野生型CHO-K1無(wú)明顯差異(圖3D)。而后，通過(guò)FluidFM的方法獲得的敲除CHO-K1單克隆細(xì)胞系傳代2-5次，并通過(guò)桑格測(cè)序/ICE分析證實(shí)了基因編輯的持久性。

隨后，作者用三個(gè)獨(dú)立的注射輪重復(fù)了CHO三重KO實(shí)驗(yàn)，并評(píng)估了24小時(shí)后的細(xì)胞存活率。數(shù)據(jù)顯示，24小時(shí)后的存活率為81% +/?11%，這表明FluidFM納米注射技術(shù)本身沒(méi)有細(xì)胞毒性，且約50%的注射細(xì)胞在第7天成功克隆，KO基因型成功率> 30% 。作者還通過(guò)將實(shí)驗(yàn)獲得的的FUT8 KO、 BAX KO和Triple KO CHO-K1細(xì)胞暴露于無(wú)血清化學(xué)定義培養(yǎng)基(CDM)中，逐步降低血清狀態(tài)，評(píng)估了該方法的行業(yè)相關(guān)性。親代CHO細(xì)胞和基因編輯細(xì)胞都不受無(wú)血清條件的影響，并證明了該方案策略的工業(yè)試驗(yàn)適用性。作者還檢測(cè)了CHO-WT、CHO-FUT8 KO、CHO-BAX KO和CHO-Triple KO細(xì)胞在CDM 中mRNA轉(zhuǎn)基因表達(dá)的表達(dá)水平。得到CHO-WT和用FluidFM納米注射產(chǎn)生的所有三種不同的KO細(xì)胞都顯示出相同的表達(dá)水平(95%-98% of DsRed+細(xì)胞)。綜上所述，使用FluidFM進(jìn)行基因組工程不會(huì)損害編輯后的CHO-K1細(xì)胞的一般細(xì)胞特征和功能。此外，該技術(shù)有擴(kuò)展到其他細(xì)胞系的可能性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)制造其他藥物的高效模式，如疫苗等。

【討論與展望】

隨著CRISPR等基因編輯技術(shù)的發(fā)展，多位點(diǎn)編輯的越來(lái)越引起了研究者的重視。傳統(tǒng)的細(xì)胞系構(gòu)建實(shí)驗(yàn)中，為了得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，候選細(xì)胞系在增殖過(guò)程中被反復(fù)評(píng)估。目前需要的時(shí)間是12到14周。相比之下，通過(guò)FluidFM OMNIUM技術(shù)可以挑選單個(gè)注射編輯過(guò)的單個(gè)細(xì)胞，并從中產(chǎn)生克隆體——從轉(zhuǎn)染之日起直到克隆體被鑒定出來(lái)，不到三周的時(shí)間。大大提高了細(xì)胞系構(gòu)建的時(shí)間。

圖4. 多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM OMNIUM

FluidFM OMNIUM單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)為單細(xì)胞基因工程領(lǐng)域帶來(lái)了全新的突破，可以快速且有效地開發(fā)單克隆細(xì)胞系。傳統(tǒng)的方法適用于很常見的細(xì)胞系和基因工程策略，但當(dāng)處理不常見、罕見的或脆弱的和已知難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞類型，或者需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)（例如CRISPR多基因編輯），傳統(tǒng)的方案就非常受限制。在這些特殊情況下，F(xiàn)luidFM OMNIUM技術(shù)是少有可用的解決方案。

另外，無(wú)論您使用原代細(xì)胞、干細(xì)胞，神經(jīng)元還是任何其他已知難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，F(xiàn)luidFM OMNIUM單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)都可以可靠且輕松地遞送任何類型的可溶性化合物。

圖5. 使用FluidFM注射編碼GFP的質(zhì)粒24小時(shí)后表達(dá)GFP的神經(jīng)元(由暨南大學(xué)閆森提供，中國(guó)廣州)。

圖6. 紅色熒光顯示右旋糖酐注射后在C57BL/6 C57小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)擴(kuò)散(由北京大學(xué)孫玉杰提供，中國(guó)北京)。

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