合成肽的生產涉及多個步驟，包括脫保護、活化、偶聯(lián)和從固相支持體上切割最終序列。雜質，例如因過早鏈終止或缺失氨基酸產生的雜質，會影響最終產品的安全性和有效性，因此，必須通過液相色譜分析分離這些雜質。在液相分析中，選擇合適的流動相和色譜柱對于各組分實現(xiàn)最佳分離至關重要。
采用島津LCMS-2050單桿質譜儀，進行多種流動相、多柱的篩選，搭配LabSolutions MD軟件，有效提升合成肽相關雜質方法開發(fā)的效率。
此次研究基于一種肽和五種具有不同序列的有關雜質作為合成肽的模型樣品(表1)。制備全長肽(FLP:B-促黑素)、較短長度產物的 p.A1del、p.A1_E2del、p.A1_K3del 和 p.A1、D5del的缺失序列以及 Met(O2)(FLP 中的甲硫氨酸被氧化成甲硫氨酸砜)作為樣品。
表1 靶肽和有關雜質的序列
檢測條件
色譜柱
Shim-pack Scepter C18-120
(1.9μm,3.0x100mm)
Shim-pack GISS C18
(1.9μm,3.0x100mm）
Shim-pack Velox SP-C18
(1.8μm,3.0x100mm)
Shim-pack Scepter C8
(1.9μm,3.0x100mm)
Shim-pack Scepter Phenyl
(1.9μm,3.0x100mm)
Shim-pack GIST HP C18-AQ
(1.9μm,3.0x100mm)
柱溫：40℃
樣品溶劑：水
流動相：
A：
Line A：0.1%三fu乙酸水溶液
Line B：0.1%甲酸水溶液
Line C：10mmol/L甲酸銨（pH=4）水溶液
Line D：10mmol/L乙酸銨（pH=5）水溶液
B：
Line A：乙腈
Line B：甲醇
流速：0.5mL/min
洗脫梯度：10%B（0min）→60%B（10 min）→10%B(10.01min-15min）
紫外檢測器：220 nm
質譜系統(tǒng)：LCMS-2050
實驗結果
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不同色譜柱譜圖結果
對比流動相和色譜柱的篩選結果，水相流動相和有機相流動相的組成對 FLP 及相關雜質的分離有顯著影響?；贚abSolutions MD軟件計算評估值，如表2所示。從中選擇的分析條件進行進一步方法優(yōu)化。
表2 不同色譜柱以及檢測條件數據評估值
圖1 評估值前三的色譜分離譜圖
進一步優(yōu)化柱溫，考察篩選出評估值最高的3個檢測條件下，柱溫對于分離的影響。使用 Scepter C8-120 色譜柱，采用 0.1%甲酸和甲醇的流動相，p.A1del和 FLP 之間的分離度更好。
圖2 不同柱溫箱溫度的色譜圖
80℃(①),70℃(②),60℃(③),50℃(④),40℃(⑤)(0.1%甲酸/甲醇/ScepterC8-120)
圖3 不同柱溫箱溫度的色譜圖
80℃(① ),70℃(②),60℃(③),50℃℃(④),40℃(⑤)(10mmol/L醋酸銨 /乙腈:甲醇=50:50 /Velox SP-C18)
圖3 不同柱溫箱溫度的色譜圖
80℃(①),70℃(②),60℃(③),50℃(④),40℃(⑤)(10mmol/L醋酸銨 /甲醇/Scepter C8-120)
后期再進行進一步的條件優(yōu)化階段，通過調整起始流動相比例、梯度條件、流速等進一步提高分離度和穩(wěn)定性。
同時，使用LC-2050進行峰追蹤，方便雜質的識別。
最終結合LabSolutions MD，進行最佳條件下的設計空間評價，通過疊加設計空間自動搜索滿足多個標準的最佳條件。找到最佳的A檢測條件。實現(xiàn)雜質的有效分離。
結語
01
島津液相系統(tǒng)可自動篩選多個流動相和色譜柱，結合LabSolutions MD 提高合成肽相關雜質方法開發(fā)的工作流效率
02
島津多鍵合相色譜柱提供不同分析選擇性，助力多肽雜質分離
產品信息
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