QQ交談
您所在位置：產品搜索
請輸入產品關鍵字：
聯(lián)系方式
地址：哈爾濱市南崗區(qū)陽光綠色家園
郵編：150001
聯(lián)系人：杜強
電話：86-0451-51918828
傳真：86-0451-51918828
手機：13613677341
售后電話：86-0451-51918828
留言：發(fā)送留言
個性化：www.hljbio.com
網(wǎng)址：www.hljbio.com
商鋪：http://true-witness.com/st172141/
郵編：150001
聯(lián)系人：杜強
電話：86-0451-51918828
傳真：86-0451-51918828
手機：13613677341
售后電話：86-0451-51918828
留言：發(fā)送留言
個性化：www.hljbio.com
網(wǎng)址：www.hljbio.com
商鋪：http://true-witness.com/st172141/
技術文章
影響ELISA試驗效果常見問題原因分析及解決辦法
點擊次數(shù)：5833 發(fā)布時間：2011-6-22
ELISA概念、原理及操作步驟
ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（ Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ）的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術。此項技術自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領域。
（一） 原理
ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法（圖a）、用于檢測抗原的雙抗體夾心法（圖b）以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法（圖a）、用于檢測抗原的雙抗體夾心法（圖b）以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
（二） 操作步驟
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M，pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3. 加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5. 終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
1. 包被：用0.05M，pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3. 加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5. 終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
方法二 用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
（三） 試劑器材
1. 試劑
?。?） 包被緩沖液（PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液）:
NaCO31.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸餾水至1000ml
（2） 洗滌緩沖液（PH7.4 PBS）：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml
?。?） 稀釋液:牛血清白蛋白（BSA） 0.1克 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10％使用。
?。?） 終止液（2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。
?。?） 底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:0.2M Na2HPO4（28.4克／L） 25.7ml 0.1M 檸檬酸（19.2克／L） 24.3ml 加蒸餾水50ml。
?。?） TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:TMB（10mg／5ml無水乙醇） 0.5ml底物緩沖液（PH5.5） 10ml0.75％H2O2 32μl
?。?） ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物緩沖液（PH5.5） 1ml 3％H2O2 2μl
?。?） 抗原、抗體和酶標記抗體。
?。?） 正常人血清和陽性對照血清。
2. 器材:
?。?） 聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。
?。?） 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
?。?） 4℃冰箱，37℃孵育箱。
1. 試劑
?。?） 包被緩沖液（PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液）:
NaCO31.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸餾水至1000ml
（2） 洗滌緩沖液（PH7.4 PBS）：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml
?。?） 稀釋液:牛血清白蛋白（BSA） 0.1克 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10％使用。
?。?） 終止液（2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。
?。?） 底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:0.2M Na2HPO4（28.4克／L） 25.7ml 0.1M 檸檬酸（19.2克／L） 24.3ml 加蒸餾水50ml。
?。?） TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:TMB（10mg／5ml無水乙醇） 0.5ml底物緩沖液（PH5.5） 10ml0.75％H2O2 32μl
?。?） ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物緩沖液（PH5.5） 1ml 3％H2O2 2μl
?。?） 抗原、抗體和酶標記抗體。
?。?） 正常人血清和陽性對照血清。
2. 器材:
?。?） 聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。
?。?） 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
?。?） 4℃冰箱，37℃孵育箱。
（四） 注意事項
1. 正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2. 在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
（1） 固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
?。?） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg／ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質來說通常為1～10μg／ml。
?。?） 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。
?。?） 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
1. 正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2. 在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
（1） 固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
?。?） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg／ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質來說通常為1～10μg／ml。
?。?） 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。
?。?） 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
五、影響ELISA試驗效果常見問題原因分析及解決辦法
ELISA試驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在研究中得到了廣泛的應用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導致顯色不全、花板等結果。我將操作中各個環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結于下，以期給同行帶來一些啟發(fā)，提高試驗質量。
| 步驟 | 可能原因 | 解決辦法 |
| 選擇 試劑 | 選擇質量優(yōu)良的檢測試劑，嚴格按照試劑說明書進行操作， 操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。 | |
| 加 樣 | 1.血清或血漿標本分離不好即進行加樣； 2.手工操作中，加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時間過長（特別是室內溫度較高時）； 3.加完標本再加酶試劑時酶濺出孔外。 | 1.標本為血清：將血液先自然存放1-2小時后，再用3000rmp離心15分鐘；標本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標本收集管，采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次，放置一段時間后，3000rpm離心15分鐘；若在幾天內檢測，可放在2-8℃冰箱中，若要貯存，則置于-20℃的低溫冰箱內。 2.加樣后及時放入孵箱。 3.加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。 4.如果采用AT或其他全自動加樣，選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。 5.標本較多時，請分批操作。 |
| 孵 育 | 1.孵育時未貼封片或加蓋，使標本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗*； 2.孵育時間人為延長，導致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗*。 | 1.貼封片或加蓋； 2.按說明步驟嚴格控制操作時間。 |
| 洗 板 | 1.采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。 2.采用半自動洗板機洗板時，洗液量不足，導致洗板不*；洗板針堵塞，抽吸不*；洗板不暢，導致洗板效果差。 3.反應板過多造成洗板等待時間長。 | 1.保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干； 2.合理安排，或多用幾臺洗板機。 |
| 顯 色 | 1. 顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑； 2. 加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。 | 1. 顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用； 2. 加樣時保持顯色劑不外流； 3.A、B液應避免接觸金屬器械。 |
| 終 止 | 加終止液時產生較多氣泡，導致假陽性增加。 | 加終止液時應避免產生氣泡。 |
| 讀 板 | 讀板時板底不清潔。 | 應保證酶標板清潔。 |
| 全過程 | 1.整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸; 2.實現(xiàn)ELISA檢測標準自動化，有效提高檢測質量。 | |
注：在實際操作中，除了選擇優(yōu)良試劑外，必須嚴格按照操作步驟進行操作，同時作好室內質控、室間質評，以嚴謹?shù)墓ぷ髯黠L檢測每一份標本，才能保證檢測質量?，F(xiàn)在國內已有相當數(shù)量的單位擁有全自動酶標儀，這對于實現(xiàn)ELISA標準化檢測、提高檢測質量起到了重要作用。