*B1酶聯(lián)免疫測(cè)試盒 96孔板

*B1（AFB1）的檢測(cè)

方法一  試紙卡法

1. 適用范圍與檢測(cè)意義：本品適用于谷物、飼料、食用油、調(diào)料和發(fā)酵酒等物質(zhì)中*B1（Aflatoxin B1簡(jiǎn)寫為AFB1）的快速檢測(cè)。*B1是目前已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性很強(qiáng)的一種，對(duì)人和若干動(dòng)物具有強(qiáng)烈的毒性，其毒性作用主要是對(duì)肝臟的損害。*B1是大部分食品的必檢項(xiàng)目之一。

2. 測(cè)定原理：本品采用高度特異性抗體抗原反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)，通過單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合AFB1-BSA偶聯(lián)物和樣品中可能含有的AFB1的原理。試劑含有被事先固定于膜上測(cè)試區(qū)（T）的AFB1-BSA偶聯(lián)物和被膠體金標(biāo)記的抗AFB1單克隆抗體。檢出限為5ng/ml。

3. 所用器皿：常量天平±0.1g；蒸發(fā)皿或燒杯；量筒；滴管；移液管；小型粉碎機(jī)；離心機(jī)等。

4. 樣品制備：

4.1 谷物：任取5g以上有代表性樣品并充分碎，準(zhǔn)確稱取2.0g均勻粉碎試樣于配套離心管中，再準(zhǔn)確加入4ml純凈水和4.0ml的乙酸乙酯，將瓶塞蓋緊密封，充分振蕩5min，離心得上清液，將上清液用吸管吸出2.0ml到蒸發(fā)皿或小玻璃杯中，用電吹風(fēng)吹干上清液，再根據(jù)樣品的種類用以下規(guī)定的稀釋液量用鋁箔袋內(nèi)配套吸管反復(fù)沖洗，*溶解杯底所有的固體，此溶解液為樣品提取液即檢測(cè)液?？紤]不同樣品對(duì)*B1的zui高含量要求，可參考下表用稀釋液溶解杯底固體：

谷物殘留*（ppb）
 2.5
 5
 10
 20
 
使用稀釋液體積（ml）
 0.4
 0.8
 1.6
 3.2
 

4.2 飼料（以殘留*50ppb計(jì)算）：任取5g以上有代表性樣品并充分粉碎，準(zhǔn)確稱取2.0g均勻粉碎試樣于配套離心管中，再準(zhǔn)確加入4ml純凈水和4.0ml的乙酸乙酯，將瓶塞蓋緊密封，充分振蕩5min，離心得上清液，將上清液用吸管出0.5ml到蒸發(fā)皿或小玻璃杯中，用電吹風(fēng)吹干上清液，再用2ml的稀釋液量用鋁箔袋內(nèi)配套吸管反復(fù)沖洗，*溶解杯底所有的固體，此溶解液為樣品提取液即檢測(cè)液。如果殘留*是30ppb，則用1.2ml的稀釋液溶解；如果殘留*是40ppb，則用1.6ml的稀釋液溶解。

4.3 食用油：稱取2.0g油樣于小燒杯中，用8ml正己烷分次將試樣轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，準(zhǔn)確加入4ml純凈水充分振蕩3min,吸去上層正己烷層,再加入4ml的乙酸乙酯，將瓶塞蓋緊密封，充分振蕩5min，靜置或離心得上清液，將上清液吸出2ml到小玻璃杯中，用電吹風(fēng)吹干，再用稀釋液溶解后為樣品提取液。

4.4 醬油、醋、發(fā)酵酒：稱取25.0g樣品于小燒杯中，用5ml蒸餾水將試樣轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞輕輕振搖3min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，經(jīng)盛有約5g預(yù)先用三氯甲烷濕潤(rùn)的無水Na2SO4過濾器于蒸發(fā)皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，zui后用少量三氯甲烷洗滌過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中，用電吹風(fēng)吹干。吹干冷卻后，準(zhǔn)確加入稀釋液，將蒸發(fā)皿中的凝結(jié)物充分溶解。

5  測(cè)定

5.1 使用前將試紙卡和待檢樣本溶液恢復(fù)至室溫。

5.2 從原包裝袋中取出試紙卡，打開后平放在桌面上，在1小時(shí)內(nèi)盡快地使用。

5.3 用滴管吸取待檢樣品溶液，滴加3滴于加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)。

5.4 結(jié)果應(yīng)在10min時(shí)讀取，超過12min的時(shí)間判讀無效。

6 結(jié)果判定

6.1 陽性：C線顯示出紅色線條，T線不顯色，或C線顯示出紅色線條，而T線顏色非常模糊時(shí)，判為陽性。表明：AFB1含量超過樣品允許量。

6.2 陰性：C線顯示出紅色線條，T線同時(shí)顯示出紅色線條，且T線顏色接近C線或者深于C線時(shí)，判為陰性。表明：AFB1含量低于樣品允許量。

6.3 無效：C線不顯示出紅色線條，而T線顯示出紅色線條，該試紙卡判為無效。建議使用新的試紙卡重新測(cè)試。

7 說明

7.1 勿觸摸試紙顯示區(qū)。

7.2 發(fā)現(xiàn)過期，破損，污染時(shí)不可再用。

7.3 本品應(yīng)保存在干燥陰涼處（4-30℃），有效期18個(gè)月，生產(chǎn)日期見包裝。

7.4 本品為一次性產(chǎn)品，勿重復(fù)使用。

7.5 如遇稀釋液不足，可用蒸餾水加入稀釋液中混勻后使用。

7.6 本品為篩選方法，任何陽性結(jié)果請(qǐng)用其它方法作進(jìn)一步確認(rèn)。

7.7 有條件的實(shí)驗(yàn)室可以用AFB1標(biāo)準(zhǔn)品作為判斷參考。

方法二 酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)試劑盒法

本測(cè)試盒用間接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法定量測(cè)定谷物中AFB1。該測(cè)試盒反應(yīng)孔可拆卸，可測(cè)單份樣品，也可測(cè)多份樣品。定量分析時(shí)需有含450nm波長(zhǎng)的微孔板酶標(biāo)儀。

1 概要

*是由曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要污染玉米、花生、堅(jiān)果等。天然污染的*以AFB1為主，AFB1屬于強(qiáng)烈致癌物質(zhì)，肝臟是其主要的靶器官，具有*的急性毒性和致癌性。

AFB1檢測(cè)方法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）和ELISA方法，本試劑盒是以應(yīng)用單克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA檢測(cè)方法，可以準(zhǔn)確快速檢測(cè)糧谷類和花生及飼料中的AFB1。

2 測(cè)定原理

本試劑盒采用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行測(cè)定。用抗原包被微孔板，加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、抗AFB1單克隆抗體進(jìn)行孵育后，將未與包被抗原結(jié)合的抗體洗去；再加入酶標(biāo)記的抗鼠IgG抗體孵育，加入顯色液，經(jīng)過終止液終止后，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定OD值。

3 提供的物品

----微孔板…………………………………………………………… 包被有AFB1-BSA

----5個(gè)濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液（各0.5mL）

標(biāo)準(zhǔn)1：0ng/mL…………………………………………………………….直接使用

標(biāo)準(zhǔn)2：0.1ng/m…………………………………………………………….直接使用

標(biāo)準(zhǔn)3：0.2ng/mL ………………………………………………………….直接使用

標(biāo)準(zhǔn)4：0.5ng/m………………………………………………….…………直接使用

標(biāo)準(zhǔn)5：1.0ng/m………………………………………….…………………直接使用

----抗AF B1單克隆抗體溶液（6mL）……………………………………………直接使用

----酶標(biāo)物（12mL）..………………………………………………………………直接使用

----顯色液（12mL）..………………………………………………………………直接使用

----終止液（6mL）…………………………………………………………………直接使用

----濃縮洗液（30mL）..……………………………………………………………稀釋使用

4 盒中未提供，需自備物品

----微孔板酶標(biāo)儀（可于450nm處測(cè)定）、振蕩器、粉碎機(jī)、微量移液器

----量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙

----氯化鈉（分析純）、甲醇（分析純）、去離子水或蒸餾水

5 操作者注意事項(xiàng)

        ----標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有*，應(yīng)特別小心。

----使用過的玻璃容器及*溶液用pH7的次氯酸溶液（10%v/v）浸泡過夜。

----終止液含有硫酸，避免接觸皮膚。

----每次加樣后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

----每步加樣時(shí)間應(yīng)控制在5min內(nèi)。

----孵育過程中應(yīng)避光。

----不要使用過期試劑盒。

        ----不要交叉使用不同批號(hào)的試劑盒中的試劑。

6 儲(chǔ)存條件

        ----保存試劑盒于2~8℃。不要冷凍.

        ----顯色液對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

        ----將不用的微孔板放進(jìn)原鋁箔袋中，置2~8℃保存。

7 試劑變質(zhì)的標(biāo)志

        ----標(biāo)準(zhǔn)1的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm<0.5）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8 樣品處理

----樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存。

----取5g粉碎的有代表性的樣品，加1.25g氯化鈉及25mL70%甲醇-水溶液。

----強(qiáng)力振蕩3分鐘。

----用快速定性濾紙過濾。

----取1mL濾液，加水4mL進(jìn)行稀釋。

----取50μL稀釋液進(jìn)行分析。

----*根據(jù)需要可以增減樣品量，但甲醇-水溶液的量也應(yīng)相應(yīng)增減。

9 酶免疫分析程序

----濃縮洗液為10倍濃縮液，使用時(shí)與去離子水或蒸餾水按體積比1:9稀釋后使用。

----取所需數(shù)量的板條插入微孔架，用洗液洗滌微孔板3min×2次。

----加入50mL標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到微孔，記錄樣品及標(biāo)準(zhǔn)的位置，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭。

----加入50mL抗體溶液到每個(gè)微孔（注意移液器管尖不要接觸到孔中的液體，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。

----甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入酶標(biāo)物100mL，37℃孵育60min。

    ----用洗液洗滌微孔板3min×5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入顯色液100mL（2滴），37℃孵育10~12min。

    ----每孔加入終止液50mL（1滴），立即用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm處測(cè)定吸光度值（OD值）。

注：在定量分析中，顯色液和終止液需要用移液器準(zhǔn)確量取。

10 樣品濃度計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)溶液OD值與標(biāo)準(zhǔn)1OD值的比值為縱坐標(biāo)，所對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng/mL）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值與標(biāo)準(zhǔn)1OD的比值，可從曲線上得到對(duì)應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為AFB1濃度的對(duì)數(shù)值，求得反對(duì)數(shù)即為測(cè)定液中AFB1濃度C（ng/mL），按下列公式計(jì)算出樣品中AFB1含量：

AFB1含量（mg/kg）= C×K

式中：C：稀釋后樣品提取液中AFB1含量（ng/mL）

            K：樣品稀釋倍數(shù)（按照本說明書中樣品處理程序方法為25）

11試劑盒主要技術(shù)指標(biāo)及參數(shù)

測(cè)試盒zui低檢出濃度0.1ng/mL，回收率70%~120%，與AFB2的交叉反應(yīng)系數(shù)小于1%，與AFG1的交叉反應(yīng)系數(shù)為4.65%，與AFG2交叉反應(yīng)系數(shù)小于1%。試劑盒校正曲線的線性范圍0.1~1.0ng/mL，試劑盒條內(nèi)變異＜10%，條間變異＜15%。