液相色譜(HPLC)作為一種分離技術(shù)和方法，目前已經(jīng)發(fā)展到一個(gè)全新的階段。高精度的輸液泵，應(yīng)用廣泛的色譜分離柱，低噪音、高靈敏度的各種檢測(cè)器和功能強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)的出現(xiàn)，都推動(dòng)了液相色譜技術(shù)的迅猛發(fā)展。液相色譜儀正以它分辨率高、分析速度快和應(yīng)用廣泛的優(yōu)點(diǎn)倍受儀器分析工作者的青睞，廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)等領(lǐng)域。作者本人從事液相色譜分析工作二十多年，應(yīng)用HPLC技術(shù)在血藥濃度、生物胺、核苷酸、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定等實(shí)際工作中，積累了許多的方法和經(jīng)驗(yàn)，在這里與大家交流，希望能對(duì)同行們有所幫助和借鑒，共同促進(jìn)液相色譜分析技術(shù)的發(fā)展。
 

　　1　液相色譜儀的基本工作原理
 

　　液相色譜儀如圖1所示，是由溶液貯器、高壓泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離柱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)幾部分組成。
 

　　高壓泵從溶液貯器中抽走流動(dòng)相，流經(jīng)整個(gè)儀器系統(tǒng)，形成密閉的液體流路。樣品通過(guò)進(jìn)樣系統(tǒng)注入色譜分離柱，在柱內(nèi)進(jìn)行分離。柱流出液進(jìn)入檢測(cè)器，使已被分離的組分逐一被檢測(cè)器收集，并將響應(yīng)值轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)后經(jīng)放大被數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜峰，通過(guò)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)記錄的峰值進(jìn)行存儲(chǔ)和計(jì)算[1]。
 

　　液相色譜儀是依靠色譜柱進(jìn)行分離的。研究證明：物質(zhì)的色譜過(guò)程是指物質(zhì)分子在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相(液相和固相)中分配“平衡”的過(guò)程。液相色譜是以具有吸附性質(zhì)的硅膠顆粒為固定相，各種洗脫液為流動(dòng)相。當(dāng)液體樣品在載體流動(dòng)相的推動(dòng)下，在液-固兩相間作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于各組分在兩相中的分配系數(shù)(K)不同，則使各自的移動(dòng)速度不同，即產(chǎn)生差速遷移。各組分在兩相間經(jīng)過(guò)多次分配，從而達(dá)到使混合物分離的目的。
 

　　上式反映了物質(zhì)在兩相中進(jìn)行吸附、解吸、再吸附、再解吸…過(guò)程中，由于在兩相中濃度的不同，而存在分配系數(shù)上的差異。
 

　　既然分配系數(shù)及其差異是引起組分在液相色譜柱分離的根本原因，那么，必然地也會(huì)同色譜理論中可測(cè)宏觀量之間存在著某種定量關(guān)系，事實(shí)上，色譜理論中通常用容量因子k’的概念來(lái)反映物質(zhì)在兩相中的分配關(guān)系k’值可以非常方便地表達(dá)組分在兩相的分配，又很容易從色譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中直接測(cè)得，是色譜理論中重要的基本參數(shù)之一[2]。
 

　　2　輸液泵的常見(jiàn)故障及對(duì)策
 

　　輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量和壓力穩(wěn)定的重要儀器部件，目前多用往復(fù)式恒流柱塞泵，主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個(gè)單向閥組成，用馬達(dá)帶動(dòng)凸輪驅(qū)動(dòng)柱塞桿作吸液和排液的往復(fù)運(yùn)動(dòng)。常分為單柱塞泵、并聯(lián)柱塞泵、串聯(lián)柱塞泵和柱塞隔膜泵等類型。流動(dòng)相混合方式分為低壓混合和高壓混合。常見(jiàn)泵的故障主要有以下幾種，并提供解決的辦法。
 

　　2.1　單向閥故障 由于球與閥座密封不嚴(yán)，液體倒流，造成壓力不穩(wěn)，甚至球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴(yán)主要是污染或氣泡引起，球與閥座粘連也是由于污染和磨損造成。
 

　　為避免單向閥中的寶石球和閥座被污染，流動(dòng)相應(yīng)使用HPLC級(jí)的溶劑，并且配好的流動(dòng)相一定要用0.45u濾膜過(guò)濾和脫氣。如果泵被微粒污染，可分別用水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。沖洗時(shí)應(yīng)打開(kāi)泄液閥，zui后再用所用的溶液沖洗整個(gè)系統(tǒng)。
 

　　氣泡進(jìn)入閥中會(huì)緊貼在閥體的一側(cè)，使寶石球難返回到閥座，引起倒流，泵的壓力和流速會(huì)明顯改變。此時(shí)，應(yīng)立即打開(kāi)泄液閥，大流量(2ml/min)沖洗泵，直至排除液為直線型。因?yàn)榧状伎蓾?rùn)濕泵內(nèi)壁，擠出氣泡，故也可使用脫過(guò)氣的甲醇沖洗泵。長(zhǎng)期不用的泵或新裝的泵頭應(yīng)該用甲醇趕氣泡。泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡，即用扳手固定住進(jìn)氣泡的泵頭，擰開(kāi)輸出管道的壓帽，手動(dòng)泵送液，可見(jiàn)到氣泡從孔中擠壓出來(lái)，直至無(wú)氣泡排出將壓帽擰緊[3]。
 

　　采取上述辦法仍不能使壓力穩(wěn)定，應(yīng)考慮是否密封墊壞了？或單向閥磨損、球不光滑等，需更換部件。
 

　　2.2　泵墊圈故障　泵墊圈常見(jiàn)的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)一般情況下不要使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液，因?yàn)檫@會(huì)損壞密封墊和柱塞桿。密封墊圈與運(yùn)動(dòng)著的柱塞桿緊密接觸，可使柱塞在泵頭自由運(yùn)動(dòng)而流動(dòng)相不漏出來(lái)，它是液相色譜系統(tǒng)中zui易磨損的部件。有條件的實(shí)驗(yàn)室可三個(gè)月更換一次墊圈，防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動(dòng)相則更會(huì)加速墊圈的磨損，應(yīng)及時(shí)沖洗。當(dāng)墊圈損壞時(shí)，表現(xiàn)為：泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。一旦出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象，應(yīng)盡快更換新墊圈。
 

　　為避免上述故障的發(fā)生，我們?cè)诜治龉ぷ髦袘?yīng)注意以下幾點(diǎn)：
 

　?、?使用超純水(18MΩ.cm)、純度級(jí)別較高的試劑和色譜級(jí)溶劑配制流動(dòng)相；
 

　　② 配好的流動(dòng)相一定要抽濾脫氣，即便儀器有在線脫氣裝置，也在上機(jī)前進(jìn)行抽濾。真空抽濾既過(guò)濾顆粒也脫了氣泡，非常有效。
 

　　③ 泵在起動(dòng)前一定要通過(guò)泄液閥抽凈泵里的空氣。
 

　　④ 用緩沖鹽洗脫時(shí)，分析結(jié)束后一定要用水沖洗泵和整個(gè)流路系統(tǒng)，不要讓腐蝕性溶液滯留泵中，zui后用有機(jī)溶劑充滿系統(tǒng)。
 

　　3　色譜分離柱的使用與維護(hù)
 

　　在前述儀器工作原理部分，我們已經(jīng)指出，液相色譜儀的分離是在色譜分離柱中實(shí)現(xiàn)的。我們目前工作中多采用反相色譜柱，如何保護(hù)好分離柱減少柱的污染是延長(zhǎng)柱壽命的關(guān)鍵。
 

　　3.1　怎樣維護(hù)好色譜分離柱
 

　　加保護(hù)柱(預(yù)柱)是保護(hù)分離柱的有效辦法。保護(hù)柱是根內(nèi)裝填料與分離柱性質(zhì)相近的短柱，接在分離柱之前，或代替流路過(guò)濾器。保護(hù)柱的作用是收集和阻塞分離柱口的化學(xué)垃圾，這些垃圾如果直接進(jìn)入分離柱會(huì)逐漸堆積在柱頭，zui終降低柱效能。保護(hù)柱是消耗品，如分析血漿樣品，一般分析50個(gè)樣品后需更換新柱芯。
 

　　避免高壓沖擊分離柱。一般色譜柱都能承受得起高壓，但經(jīng)不住突然變化的高壓沖擊，這將改變柱床體積，影響柱效。引起高壓沖擊的原因主要有：進(jìn)樣器的樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)、泵啟動(dòng)太快、柱切換等操作。用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)的壓力變化不大，自動(dòng)進(jìn)樣閥由于切換較慢，可能會(huì)造成壓力沖擊。
 

　　合理選擇分離柱。我們知道，選擇色譜分離柱主要根據(jù)兩點(diǎn)，一是根據(jù)待測(cè)組分的分子量的大?。欢歉鶕?jù)流動(dòng)相條件，包括PH值、離子強(qiáng)度和溶劑極性等。傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的鍵合相柱要求流動(dòng)相PH值在3-7之間，PH值(>8)的流動(dòng)相能溶解硅膠，使鍵合相流失。而目前利用先進(jìn)的雜化顆粒技術(shù)研制的高純硅膠顆粒填料(如Waters公司的XTerra色譜柱)，集硅膠和多孔聚合物填料的優(yōu)點(diǎn)為一體，使有機(jī)硅烷單元取代了相當(dāng)一部分占據(jù)顆粒內(nèi)部和表面位置的硅羥基，使這種新型填料具有分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、PH范圍寬(1-12)的優(yōu)勢(shì)，其性能突破了傳統(tǒng)液相色譜柱的極限。所以一定要根據(jù)分析的對(duì)象、流動(dòng)相的條件選擇合適的分離柱，茫然時(shí)可向公司的技術(shù)人員咨詢。
 

　　定期沖洗分離柱。每次分析工作結(jié)束時(shí)，沖洗完緩沖鹽后，zui后要過(guò)度到用強(qiáng)溶劑沖洗柱子，如可用色譜純甲醇、乙腈沖洗反相C18柱，目的是沖去吸附在柱上的強(qiáng)保留組分。如果用甲醇/水為流動(dòng)相也應(yīng)這樣沖洗柱子，在一定程度上可恢復(fù)柱效。