上海旦鼎 流式細(xì)胞儀使用方法

 一．開機(jī)程序
 

  1．檢查穩(wěn)壓器電源，打開電源，穩(wěn)定5分鐘。

  2．打開儲液箱，倒掉廢液, 

  并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。打開壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水，做分選必須用PBS或FACSFlow)，合上壓力閥。確實蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。

  3．將FACSCalibur開關(guān)打開，此時儀器功能控制鈕的顯示應(yīng)是STANDBY，預(yù)熱5－10分鐘。排出過濾器內(nèi)的氣泡。

  4．如果需要打印，打開打印機(jī)電源。

  5．打開電腦,等待屏幕顯示出標(biāo)準(zhǔn)的蘋果標(biāo)志。

  6．執(zhí)行儀器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的氣泡。

  7．分析樣品時，先用FACAFlow 或PBS進(jìn)行HIGH RUN約2分鐘。

做過分選后，每次開機(jī)后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個50ml離心管，不接通濃縮系統(tǒng)，摁下右下角白色按鈕開始沖洗。待自動停止
后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。
 

二．預(yù)設(shè)獲取模式文件(Acquisition Template Files)
 

  1．從蘋果標(biāo)志中選擇CELLQuest見一個新視窗，可利用此視窗編輯一個獲取模式文件。

  2．選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot，繪出一個或多個Dot Plots(點圖)。從Dot Plot對話框中選取Acquisition作為圖形資料來源，并確定適當(dāng)?shù)膞軸和y軸參數(shù)。

  3．選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram，同上法可繪出Histogram(直方圖)。

  4．將此視窗命名后儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夾中，下次進(jìn)行相同實驗時可直接調(diào)用。

本計算機(jī)中已設(shè)定兩個模式文件：ACQ和EXP，儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest  \EXP文件夾中，ACQ用于細(xì)胞DNA檢測，EXP用于細(xì)胞表面標(biāo)志分析。

 
 三．用CELLQuest進(jìn)行儀器的設(shè)定和調(diào)整

  1．從蘋果畫面中選取CELLQuest，進(jìn)入CELLQuest后在File指令欄中打開合適的獲取模式文件。

  2．從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer(快捷鍵： ＋B)進(jìn)行電腦和儀器的連機(jī)。將出現(xiàn)的Acquisiton  Control對話框移至合適位置。

  3．從Cytometer指令欄中，開啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四個對話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數(shù)據(jù)時隨時調(diào)整獲取條件。也可以用 +1，2，3，4獲得此四個對話框。

  4．在Detectors/Amps對話框中，先為每個參數(shù)選擇適當(dāng)?shù)谋对瞿Ｊ?amplifier mode)：線性模式Lin或?qū)?shù)模式Log。一般進(jìn)行細(xì)胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細(xì)胞亞群時，F(xiàn)SC和SSC多以線性模式Lin測量，且DDM Param選擇FL2，而FL1,  FL2與FL3則以對數(shù)模式Log測量；分析細(xì)胞DNA含量時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3皆以Lin進(jìn)行測量，且DDM Param選擇FL2；分析血小板表型時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3等均以Log進(jìn)行測量。

  5．放上待檢測的樣品，將流式細(xì)胞儀設(shè)定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。

  6．在Acquisiton 

  Control對話框中，選取Acquire，開始獲取細(xì)胞。在以下的儀器調(diào)整過程中隨時選取Pause，Restart以觀察調(diào)整效果。未*調(diào)整好之前不要去掉SETUP前的“?”。

  7．在Detectors/Amps對話框中，調(diào)整FSC和SSC探測器中的信號倍增度：PMT voltages(粗調(diào))與Amp Gains(細(xì)調(diào))，使樣品信號出現(xiàn)在FSC-SSC點圖內(nèi),且三群細(xì)胞合理分布。

  8．在Threshold 

  對話框中選擇適當(dāng)?shù)膮?shù)設(shè)定Threshold，并調(diào)整Threshold的高低，以減少噪音信號(細(xì)胞碎片)。一般做細(xì)胞表型時用FSC－H而做DNA時用FL2－H。Threshold并不影響檢測器對信號的獲取，但可改善畫面質(zhì)量。

  9．從屏幕左列繪圖工具中選取Region(區(qū)域)，并在靶細(xì)胞周圍設(shè)定區(qū)域線，即通常所說的門。圈定合適的細(xì)胞群可使儀器調(diào)整更為容易。

  10．Detectors/Amps對話框中，調(diào)整熒光檢測器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根據(jù)所用的熒光陰性對照樣品調(diào)整細(xì)胞群，使之分布在正確的區(qū)域內(nèi)。

  11．在Compensation對話框中，根據(jù)所用的調(diào)補(bǔ)償用標(biāo)準(zhǔn)熒光樣品調(diào)整雙色(或多色)熒光染色所需的熒光補(bǔ)償。比如應(yīng)該為FL1+ FL2- 

  的細(xì)胞群卻分布在FL1＋ FL2＋區(qū)域內(nèi)，則需調(diào)大FL2－？％FL1中的“？”，并從FL1-FL2點圖中觀察新的調(diào)整是否恰當(dāng)

  12．在Status對話框中可見：Laser Power:正常值—Run/Ready為14.7mW，Standby為5mW；Laser current:正常值為6Amps左右。

  13．調(diào)整好的儀器設(shè)定可在Instrument Settings對話框中儲存，下次進(jìn)行相同實驗時可調(diào)出使用，屆時只需微調(diào)即可。

 本計算機(jī)中已有三個名叫儲存于FACStation G3 \BD Applications \CELLQuest Folder\IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files\CalibFile和Mast-Cell-Set的參數(shù)文件，前二者可用于分析人白細(xì)胞，后者用于分析小鼠肥大細(xì)胞。