上海旦鼎講解降落PCR的原理及常見問題解答

提問：降落PCR（Touchdown PCR）的原理？  

回答：Touchdown PCR是指每隔一個(gè)循環(huán)降低1°C反應(yīng)退火溫度，直至達(dá)到“Touchdown"退火溫度，然后以此退火溫度進(jìn)行10個(gè)左右的循環(huán)。該方法最初出現(xiàn)是為了避開確定最佳退火溫度而進(jìn)行的復(fù)雜的反應(yīng)優(yōu)化過程。正確和非正確退火溫度之間的任何差異將造成每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物量的兩倍差異（每攝氏度造成4倍差異）。因此相對(duì)于非正確產(chǎn)物，正確的產(chǎn)物可以得到富集該方法的另一個(gè)應(yīng)用是在確定已知序列肽的DNA序列。

具體過程如下：使用兩套與已知序列肽兩末端可能配對(duì)的簡并引物，這只需要知道一段長為13個(gè)氨基酸的肽段序列，5’和3’引物各長18個(gè)堿基（6個(gè)氨基酸），兩者之間有一個(gè)堿基以上的間隔。使用簡并引物即可以進(jìn)行“Touchdown PCR"。由這種方法將獲得大量的產(chǎn)物，但因?yàn)橛呻男蛄锌梢灾酪镏g的確切距離，所以可以根據(jù)產(chǎn)物的大小來選擇所需要的產(chǎn)物。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以富集引物與模板正確配對(duì)的產(chǎn)物。如果克隆和測(cè)需一打PCR產(chǎn)物，將可以確定肽的正確編碼序列，設(shè)計(jì)進(jìn)行雜交的寡核苷酸等。該技術(shù)特別適用于由Ser，Lys和Arg（每個(gè)有6個(gè)密碼子）構(gòu)成的多肽。

 提問：降落PCR的優(yōu)點(diǎn)？

回答：綜合比較普通PCR技術(shù)和最大耐受量聚合酶鏈反應(yīng)，認(rèn)為前者程序簡單，省時(shí)，一般的PCR擴(kuò)增儀都可完成，但缺點(diǎn)是退火溫度不適當(dāng)時(shí)容易出現(xiàn)假陽性;而最大耐受量聚合酶鏈反應(yīng)雖然程序復(fù)雜，需要擴(kuò)增儀有較大的內(nèi)存，但能非常有效地降低或避免假陽性，且不在理想的工作條件（比如最佳鎂離子濃度）下也可擴(kuò)增出產(chǎn)物。 

這就是降落PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)吧。不過我認(rèn)為。如果能用普通PCR技術(shù)擴(kuò)出來的話，盡量用普通的聚合酶鏈反應(yīng)，雖然降落聚合酶鏈反應(yīng)比較省事省力，但是，它在一個(gè)很寬的退火溫度里擴(kuò)增，亂七八糟的條帶肯定比較多哈。雖然，電泳可能看不到。

降落PCR的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以增加某些基因的特異性,不僅我自己在擴(kuò)基因的艱難歷程中,發(fā)現(xiàn)了這一優(yōu)點(diǎn),而且也推薦給周圍的人,如果常規(guī)PCR循環(huán)程序的基因擴(kuò)增效果不佳,我就來熱啟動(dòng)加降落PCR.在非特異性背景較高的情況下,這招的確有效,但不絕對(duì)。

（參考文獻(xiàn)：一種優(yōu)化的PCR方法 降落PCR擴(kuò)增目的基因
江蘇臨床醫(yī)學(xué)雜志 2002年02期
目的 :嘗試用一種新的PCR方法———降落PCR擴(kuò)增目的基因。方法 :在構(gòu)建人CD137-hIgG1Fc - pCDNA3融合蛋白真核表達(dá)載體以及在檢測(cè)HBV多聚酶YMDD變異的過程中運(yùn)用降落PCR擴(kuò)增目的基因。結(jié)果 :擴(kuò)增出的特異性條帶與目的基因大小一致。結(jié)論 :降落PCR省卻了常規(guī)PCR中摸索最適退火溫度的過程 ,對(duì)一些Tm值相近的PCR反應(yīng)可應(yīng)用一套溫度程序擴(kuò)增 ,是一種行之有效的PCR方法。
下載附件：）

提問：溫度梯度PCR功能與降落PCR功能的區(qū)別？如：溫度梯度PCR,如25個(gè)循環(huán)的退火溫度為50℃~60℃，40秒；和降落PCR有什么不同之處，退火溫度從60℃~50℃，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降低1℃；效果是不是都是一樣？

回答：溫度梯度PCR是指在退火溫度不太明確時(shí)，為了找到優(yōu)退火溫度，在一臺(tái)PCR儀上同時(shí)做多管PCR，每一管放在儀器內(nèi)不同列（有的是不同行）上，分別進(jìn)行PCR（如50℃~60℃可以分6管，分別為50，52，54，56，58，60度），最后看看哪個(gè)溫度的效果好。總之是用來進(jìn)行退火溫度優(yōu)化的。

降落PCR是在同一個(gè)PCR管內(nèi)進(jìn)行PCR，只是每個(gè)循環(huán)的溫度不同（如每個(gè)循環(huán)降1度）。一般兼并引物用這種方法多些。

提問：我的兩條引物說明書的Tm值分別為69℃、62℃，若用降落PCR如何設(shè)定溫度范圍？回答：這兩個(gè)TM值相差有點(diǎn)大,一般不要超過三度,我認(rèn)為你的退火溫度就在62,63度左右,你可以先試試,如果你想做降落PCR,那么你可以先用高的退火溫度做幾個(gè)循環(huán),然后在換到較低退火溫度做幾個(gè)循環(huán),然后再用更低的溫度做剩下的循環(huán),對(duì)于你這個(gè),你可以先用65度左右做5個(gè)循環(huán),然后在60度左右做5個(gè)循環(huán),其余在58度做剩下的循環(huán),只是經(jīng)驗(yàn),不一定能出來.

提問：什么情況下需要做降落PCR？

回答：主要是在出現(xiàn)非特異條帶時(shí)可以考慮用降落PCR,在高的退火溫度下做幾個(gè)循環(huán),這樣擴(kuò)出的產(chǎn)物特異性好,可以做為后續(xù)反應(yīng)的模板,然后再溫度較低的情況下以前面擴(kuò)出來的較特異的產(chǎn)物做模板,這樣不但特異性好,而且產(chǎn)物也夠多,可以出現(xiàn)很好的結(jié)果。

還有就是在剛合成引物還未經(jīng)鑒定效果的時(shí)候,可以用降落PCR ,但是正如上面說的你的兩個(gè)引物的TM值相差的有點(diǎn)大,一般降落是在TM值以下3-5度開始將,每個(gè)循環(huán)降0.5或1度,降差不多十個(gè)循環(huán)后,再維持在最后一個(gè)循環(huán)的溫度上,不要擔(dān)心最后的循環(huán)數(shù)目不夠,其實(shí)只要模板量沒問題,二十個(gè)循環(huán)足夠了。

提問：剛合成的引物用降落PCR的原因是什么??？

回答：因?yàn)槔碚撚?jì)算的TM值用來確定退火的溫度只是一個(gè)參考呀,最合適的退火溫度會(huì)因?yàn)楦鞣N原因而有所差異,就連PCR儀都會(huì)有影響的,我們實(shí)驗(yàn)室就是,好多都是在一臺(tái)能拉出條帶,而在另一臺(tái)上就拉不出條帶,或者相反的。

降落（TD）PCR代表了一種不同的PCR優(yōu)化方法。由于開始時(shí)的退火溫度選擇高于估計(jì)的Tm值，隨著循環(huán)的進(jìn)行，退貨溫度逐漸降到Tm值，并最終低于這個(gè)水平。此策略有利于確保第一個(gè)引物－模板雜交事件發(fā)生在最互補(bǔ)的反應(yīng)物之間，即那些產(chǎn)生目的擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)物之間。盡管退火溫度最終會(huì)降到非特異性雜交的Tm值，但此時(shí)目的擴(kuò)增產(chǎn)物已開始幾何擴(kuò)增，在剩下的循環(huán)中處于滯后（非特異性）PCR產(chǎn)物的地位。有人研究發(fā)現(xiàn)一些本來產(chǎn)生滿意的單一擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)采用TD PCR時(shí)變得更好進(jìn)行了。

提醒一下，如果說明書上的Tm值和Oligo或者Primer上分析的差別挺大的，你要以軟件上的計(jì)算為準(zhǔn)。 我覺的你兩個(gè)引物Tm值差的太多，不過你也可試。68度開始，每個(gè)循環(huán)下降0.5度，或者0.2度，最后62度來個(gè)20循環(huán)。