熒光定量PCR方法介紹

熒光定量PCR熒光為基礎(chǔ)對(duì)核酸進(jìn)行定量分析，其應(yīng)用非常廣泛，可以用于檢測(cè)基因的表達(dá)量（RNA的豐度），驗(yàn)證表達(dá)譜芯片或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)，確定病原體的載量，對(duì)片段的拷貝數(shù)（CNV）進(jìn)行分析，對(duì)基因進(jìn)行分型等等。其原理為通過監(jiān)控反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度的變化，記錄檢測(cè)熒光達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)（Ct值）。從理論上說，起始模板量和Ct值密切相關(guān)，因此我們通過判讀Ct值從而對(duì)樣本進(jìn)行定量。熒光定量PCR從方法上來(lái)說可以分為染料法和探針法兩種。

染料法

在國(guó)內(nèi)，染料法一般采用DNA染料SYBRGreenⅠ，染料法使用簡(jiǎn)單，成本也相對(duì)較低，因此會(huì)有很多國(guó)內(nèi)研究者會(huì)選擇使用染料法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在染料法熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中，染料能夠與雙鏈結(jié)合，從而發(fā)光，而在游離狀態(tài)下，SYBRGreen I發(fā)出微弱的熒光。所以，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出線的雙鏈DNA量呈比列，且會(huì)隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。

但是染料法檢測(cè)的是體系中的所有雙鏈DNA，因此一些非特異性擴(kuò)增或者引物二聚體的出現(xiàn)，會(huì)極大的影響真實(shí)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此，一些廠商提供ROX作為內(nèi)部熒光參考標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)校正背景，但是即便如此，染料法特異性的問題依舊無(wú)法與探針法相比。另外染料法無(wú)法在同一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)多個(gè)目的片段，對(duì)于復(fù)雜序列，如果難以擴(kuò)增的話，也會(huì)受到脫靶效應(yīng)（如引物二聚體）的影響。在這種情況下，就需要在實(shí)驗(yàn)前期進(jìn)行熔解曲線分析，判斷擴(kuò)增所得產(chǎn)物是否只有一種。

TaqMan探針法

TaqMan探針法PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)擴(kuò)增引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。Taqman探針為一段線性的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（FAM或Hex等）和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，PCR儀檢測(cè)不到熒光信號(hào)；當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段），Taq酶的5' －3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR 產(chǎn)物形成*同步，這也就是探針法定量的原理。

探針法與染料法的較為大區(qū)別在于，理論上探針法中的熒光信號(hào)只來(lái)源于目標(biāo)序列，也就是不受非特異性擴(kuò)增及引物二聚體的影響。除此之外，人們還可以利用不同探針，在一個(gè)體系中使用不同的熒光標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)多種指標(biāo)，達(dá)到節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本的目的。在樣本量比較大的情況下，成本甚至可以低于染料法。

因此我們可以看到，在選擇熒光定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，探針法在特異性和準(zhǔn)確性方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于廉價(jià)的染料法，但在實(shí)際使用時(shí)，TaqMan探針高昂的價(jià)格常常讓人望而卻步。目前，上海捷瑞生物工程有限公司在強(qiáng)大的探針合成能力的前提下，推出了探針法熒光定量PCR服務(wù)，以染料法的價(jià)格，享受探針法的服務(wù)，在相同的經(jīng)費(fèi)情況下，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和特異性。

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