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定量實(shí)時(shí) PCR 引物套裝

我們的目標(biāo)是提供一種具有成本效益的方法來驗(yàn)證 NGS 或微陣列數(shù)據(jù)并使用實(shí)時(shí) qPCR 測定定量基因表達(dá)
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提供有關(guān)最佳反應(yīng)條件的詳細(xì)信息 提供
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概述 - 定量“實(shí)時(shí)"PCR 或 qPCR
定量實(shí)時(shí) PCR *改變了我們測量核酸濃度的能力,并且是驗(yàn)證由微陣列分析和其他基因組學(xué)技術(shù)生成的表達(dá)數(shù)據(jù)的重要步驟。實(shí)時(shí) qPCR 儀器的開發(fā)促進(jìn)了這一點(diǎn),該儀器可測量反應(yīng)每個(gè)步驟或“實(shí)時(shí)"產(chǎn)生的 qPCR 產(chǎn)物的量。SYBR green 是目前流行的實(shí)時(shí) PCR 方法,因?yàn)樗鄬θ菀缀涂煽?。在?shí)時(shí) PCR 技術(shù)發(fā)展之前,定量測量需要建立多個(gè) PCR 反應(yīng),以便在擴(kuò)增的線性階段捕獲 qPCR 產(chǎn)物。然后通過凝膠電泳或 HPLC 對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分離和定量。這些實(shí)驗(yàn)非常費(fèi)力,實(shí)現(xiàn)正確定量所需的操作次數(shù)增加了引入錯誤的可能性。因此,可以在每個(gè)熱循環(huán)中測量 PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí) PCR 儀器的開發(fā)提高了定量 PCR 的簡便性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)了各種應(yīng)用。這些包括 1) 驗(yàn)證通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù),2) DNA 拷貝數(shù)的測量,3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量,4) 突變/SNP 分析,以及5)miRNA表達(dá)??梢栽诿總€(gè)熱循環(huán)中測量 PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí) PCR 儀器的開發(fā)提高了定量 PCR 的簡便性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)了各種應(yīng)用。這些包括 1) 驗(yàn)證通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù),2) DNA 拷貝數(shù)的測量,3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量,4) 突變/SNP 分析,以及5)miRNA表達(dá)。可以在每個(gè)熱循環(huán)中測量 PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí) PCR 儀器的開發(fā)提高了定量 PCR 的簡便性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)了各種應(yīng)用。這些包括 1) 驗(yàn)證通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù),2) DNA 拷貝數(shù)的測量,3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量,4) 突變/SNP 分析,以及5)miRNA表達(dá)。
通常,實(shí)時(shí) PCR 協(xié)議類似于標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)。同樣的問題也適用于產(chǎn)生干凈的模板、設(shè)計(jì)引物和優(yōu)化反應(yīng)條件。主要區(qū)別在于加入了嵌入劑(例如 SYBR green)或使用熒光引物檢測 PCR 產(chǎn)物。在典型的反應(yīng)中,qPCR 產(chǎn)物以指數(shù)方式產(chǎn)生。因?yàn)樽銐虻漠a(chǎn)品需要幾個(gè)循環(huán)才能很容易檢測到,所以熒光與循環(huán)數(shù)的關(guān)系圖呈現(xiàn)出 S 形外觀。在隨后的循環(huán)中,反應(yīng)底物耗盡,qPCR 產(chǎn)物不再加倍,曲線開始變平。曲線上熒光量開始迅速增加的點(diǎn),通常比基線高幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差,稱為閾值循環(huán)(Ct 值)。Ct 與模板的關(guān)系圖是線性的,因此多個(gè)反應(yīng)之間的 Ct 值比較可以計(jì)算目標(biāo)核酸的濃度。這條線的斜率提供了 qPCR 效率的度量。
PCR產(chǎn)物可以通過產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量或相對于對照基因進(jìn)行定量?;跇?biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí) PCR 定量可以利用質(zhì)粒 DNA 或其他形式的 DNA,其中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的絕對濃度是已知的。然而,必須確定的是,標(biāo)準(zhǔn)品的 PCR 效率與“未知"樣本的效率相同。在某些情況下,從純化的靶標(biāo)進(jìn)行 PCR 可能比使用復(fù)雜核酸混合物觀察到的更有效。相對定量方法稍微簡單一些,因?yàn)樗枰獪y量管家或?qū)φ栈騺順?biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)基因的表達(dá)。然而,選擇合適的對照基因可能會導(dǎo)致問題,因?yàn)樗鼈儾灰欢ㄔ谒形粗獦颖局芯缺磉_(dá)。
執(zhí)行實(shí)時(shí) PCR 的一個(gè)關(guān)鍵方面是從高純度的模板開始。在處理一些生物樣本時(shí),這可能具有挑戰(zhàn)性。幸運(yùn)的是,已經(jīng)開發(fā)了許多商業(yè)產(chǎn)品來促進(jìn)高純度核酸的分離。去除污染的苯酚和不需要的 DNA 是需要考慮的步驟。對于基因表達(dá)研究,必須使用高純度試劑和多次重復(fù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,因?yàn)榇瞬襟E可能會在模板復(fù)制中引入可變性。逆轉(zhuǎn)錄可以在實(shí)時(shí) PCR 之前進(jìn)行,或者可以合并到擴(kuò)增程序中。