人饑餓素  （ghrelin）酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
檢測范圍：                                                                                                                  96T
50ng/L - 1600ng/L
使用目的：
本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關液體樣本中饑餓素  （ghrelin）含量。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人饑餓素  （ghrelin）水平。用純化的人饑餓素
（ghrelin）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入饑餓素  （ghrelin），
再與 HRP 標記的饑餓素  （ghrelin）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗
滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終
的黃色。顏色的深淺和樣品中的饑餓素  （ghrelin）呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定
吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人饑餓素  （ghrelin）濃度。
試劑盒組成
1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 7 終止液 6ml×1 瓶
2 酶標試劑 6ml×1 瓶 8 標準品（3200ng/L） 0.5ml×1 瓶
3 酶標包被板 12 孔×8 條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶
4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶 10 說明書 1 份
5 顯色劑A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 張  
6 顯色劑B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 個
標本要求
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因 NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
1600ng/L 5 號標準品 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液
800ng/L 4 號標準品 150μl的5 號標準品加入150μl標準品稀釋液
400ng/L 3 號標準品 150μl的4 號標準品加入150μl標準品稀釋液
200ng/L 2 號標準品 150μl的3 號標準品加入150μl標準品稀釋液
100ng/L 1 號標準品 150μl的2 號標準品加入150μl標準品稀釋液
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、
待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡
量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。    
4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復 5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3。
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止
液后 15分鐘以內(nèi)進行。
操作程序總結：
計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的
OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值
大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
10.  如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月Human        ghrelin
FOR RESEARCH USE ONLY
Assay range：50 ng/L - 1600ng/L                                              96 determinations
Purpose
This kit allows  for the determination of ghrelin concentrations  in Human serum, cell
culture supernates and other biological fluids
Principle of the assay
The kit assay Human ghrelin level in the sample，use Purified Human ghrelin antibody
to coat microtiter plate wells, make solid-phase antibody,  then add ghrelin to wells, Combined
ghrelin  antibody  which  With  HRP  labeled  goat  anti-Human  become  antibody  -  antigen  -
enzyme-antibody  complex,  after  washing  Compley, Add  TMB  substrate  solution,TMB
substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition
of  a  sulphuric  acid  solution  and  the  color  change  is measured  spectrophotometrically  at  a
wavelength of 450 nm. The concentration of Human ghrelin in the samples is then determined
by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.
Materials provided with the kit
1 wash    solution 20ml× 1bottle 7 Stopp Solution 6ml× 1 bottle
2 HRP-Conjugate reagent 6ml× 1 bottle 8
Standard（
3200 ng/L）
0.5ml× 1 bottle
3 Microelisa stripplate 12well× 8strips 9 Standard diluent 1.5ml× 1bottle
4 Sample diluent 6ml× 1 bottle 10 Instruction 1
5 Chromogen Solution A 6ml× 1 bottle 11
Closure plate
membrane
2
6 Chromogen Solution B 6ml× 1 bottle 12 Sealed bags 1
Specimen requirements
RD1. extract as  soon  as  possible  after  Specimen  collection,and  according  to  the  relevant
literature,  and  should  be  experiment  as  soon  as  possible  after  the  extraction.  If  it  can’t,
specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.
2. Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active.
Assay procedure
1. Dilute and add sample:Dilute Original density Standard as follow table:
1600ng/L 5 Standard 150μl Original density Standard+150μl Standard diluent
800ng/L 4 Standard 150μl 5 Standard+150μl Standard diluent
400ng/L 3 Standard 150μl 4 Standard+150μl Standard diluent
200ng/L 2 Standard 150μl 3 Standard +150μl Standard diluent
100ng/L 1 Standard 150μl 2 Standard +150μl Standard diluent
2.add  sample：Set  blank  wells  separay  （blank  comparison  wells  don’t  add  sample  and
HRP-Conjugate reagent, other each step operation is same）. testing sample well. add Sample
dilution  40μl  to  testing  sample  well,  then  add  testing  sample  10μl  （sample  final  dilution  is
5-fold）, add sample to wells , don’t touch the well wall as far as possible, and Gently mix.
3.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30 min at 37℃.
4.Configurate  liquid: 30-fold （or 20-fold） wash solution diluted 30-fold （or 20-fold） with distilled
water and reserve.
5.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer
to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.
6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent 50μl to each well, except   blank well.
7.incubate：Operation with 3.
8.washing：Operation with 5.
9.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B  to each well, evade  the
light preservation for 15 min at 37℃
10.Stop  the  reaction：Add Stop  Solution50μl  to  each well,  Stop  the  reaction（the  blue  color
change to yellow color）.
11.assay：take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution and within 15min.
Steps description
Standard, Sample diluent
Add Standard, Sample diluent, incubate for 30 min at 37℃.
Wash 5 time,Add HRP-Conjugate reagent, incubate for 30 min at 37℃.
Wash 5 times,Add Chromogen Solution A and B, incubate for 30 min at 37℃.
Add Stopp Solution
Read absorbance at 450nm within 15 min
calculate
Calculate
Take  the  standard  density  as  the  horizontal,  the OD  value  for  the  vertical  ,draw  the
standard  curve on graph paper, Find out  the  corresponding  density according  to  the  sample
OD value by the Sample curve, multiplied by the dilution multiple, or calculate the straight  line regression equation of the standard curve with the standard density and the OD value ,with the
sample OD value in the equation, calculate the sample density, multiplied by the dilution factor,
the result is the sample actual density.
Important notes
1. The kit  takes out  from  the  refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes  in
the room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should
be stored in Sealed bag.
2. washing  buffer will Crystallization  separation,  it  can  be  heated  the  water  helps  dissolve
when dilute . Washing does not affect the result.
3. add  Sample  with  sampler  Each  step,  And  proofread  its  accuracy  frequently,  avoids  the
experimental error. add sample within 5 min, if the number of sample is much , recommend
to use Volley .
4. if the testing material content is excessively higher （The sample OD is bigger than the first
standard well ）,please dilute Sample （n-fold）, Please diluente and multiplied by the dilution
factor.（× n× 5）.
5. Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoid cross-contamination.
6. The substrate evade the light preservation.
7. Please  according  to  use  instruction  strictly,  The  test  result  determination must  take  the
microtiter plate reader as a standard.
8. All samples, washing buffer and each kind of  reject should according  to  infective material
process.
9. Do not mix reagents with those from other lots.
Storage and validity
1．Storage：    2-8℃.
2．validity：  six months