活體細(xì)胞線粒體膜通道孔紅色熒光（TMRM）檢測

YIJI細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子紅色熒光測定試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子紅色熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑二氫溴化乙啶，在細(xì)胞氧化條件下，產(chǎn)生紅色熒光，來檢測細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。二氫溴化乙啶（Dihydroethidium bromide；Hydroethidine；DHE）是一種*自由通過細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)長期滯留而不外漏的染色劑。一旦被超氧自由基陰離子氧化，二氫溴化乙啶轉(zhuǎn)化為溴化乙啶，進入細(xì)胞核，與DNA緊密結(jié)合，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此證明細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子活性氧族的存在。 

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）    毫升

YIJI染色液（Reagent B）    微升

YIJI稀釋液（Reagent C）    毫升

YIJI保存液（Reagent D）    毫升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存YIJI染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細(xì)胞操作所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于細(xì)胞操作的容器

1.5毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

血細(xì)胞計數(shù)儀：用于細(xì)胞計數(shù)

臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于熒光定量分析的容器

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察熒光細(xì)胞

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

實驗步驟

• 間接法

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升YIJI染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升YIJI稀釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為YIJI染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。

• 準(zhǔn)備1瓶25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測細(xì)胞
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 加入xx毫升 YIJI清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
• 小心抽去YIJI清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面
• 置入37℃培養(yǎng)箱1分種
• 振動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 加入4毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入15毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細(xì)胞直接從這一步驟開始）
• 移取10微升在血細(xì)胞計數(shù)儀上進行細(xì)胞計數(shù)
• 移出1 X 106細(xì)胞到新的15毫升錐形離心管
• 放入臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升含有YIJI染色液（Reagent B）和YIJI稀釋液（Reagent C）的YIJI染色工作液，輕柔混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放入臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的xx微升YIJI保存液（Reagent D），輕柔混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進冰槽里
• 選擇下列方式之一進行操作：
  • 即刻進行細(xì)胞流式儀分析：藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）波段，觀察50000個細(xì)胞以上――

波峰右移，表明超氧陰離子含量高

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――

紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高

• 或使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測（定量檢測）：

1）移取400微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色皿

2）加入xx微升YIJI保存液（Reagent D）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――

RFU增高，表明超氧陰離子含量高

• 直接法

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升YIJI染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升YIJI稀釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為YIJI染色工作液，置入暗室里。然后進行下列操作。

1．準(zhǔn)備1個細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的待測細(xì)胞，細(xì)胞鋪滿率達70％

（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項5）

2．小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

3．小心沿著孔壁加入xx微升含有YIJI染色液（Reagent B）和YIJI稀釋液（Reagent C）的

YIJI染色工作液到1個細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4．放進37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘

5．小心抽去含有YIJI染色工作液 

6．小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的YIJI保存液（Reagent D）到細(xì)胞培養(yǎng)孔

7．選擇下列方式之一進行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高

• 使用熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀檢測（定量檢測）：

放進熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――RFU增高，表明超氧陰離子含量高

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（1毫升體系）或40次（0.5毫升體系）操作
• 操作時，須戴手套
• 孵育時，避免光照
• 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整操作用量：

• 根據(jù)細(xì)胞類型，調(diào)整YIJI染色工作液使用劑量（1：200至1：1000容量比），避免過度染色
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進行細(xì)胞熒光分析 
• 激發(fā)波長可以選擇在485至540nm之間，散發(fā)波長565至610nm之間
• 本公司同時提供系列超氧陰離子活性氧檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰