細(xì)菌氫ATP酶活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒說明書

細(xì)菌氫ATP酶（H＋－ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒
產(chǎn)品說明書

主要用途

YIJI細(xì)菌氫ATP酶（H＋-ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用氫ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，在排除其它ATP酶干擾的情況下，受到氫ATP酶的水解產(chǎn)生的ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進行測算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細(xì)菌細(xì)胞H＋-ATP酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

氫ATP酶（H＋-ATPase；EC3.6.3.14），又稱為質(zhì)子或氫離子轉(zhuǎn)位ATP酶（Proton-Translocating ATPases），在生物能量傳導(dǎo)過程中起著重要作用。其分成三類：質(zhì)膜型（plasma membrane type）、真細(xì)菌型（eubacterial type）和囊泡型（vacuolar type）。質(zhì)膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的質(zhì)膜上，約100kd蛋白；真細(xì)菌型存在于葉綠體、線粒體和細(xì)菌上，由疏水的膜部分和親水的催化部分組成；囊泡型存在于真核生物細(xì)胞器的囊泡系統(tǒng)。氫ATP酶催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。這一去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細(xì)胞生命代謝的能源。同時利用細(xì)胞內(nèi)ATP釋放的能量逆向跨質(zhì)膜把質(zhì)子轉(zhuǎn)運出細(xì)胞，產(chǎn)生并保持細(xì)胞膜兩側(cè)H的電化學(xué)梯度，為一系列次級轉(zhuǎn)運體和通道蛋白對各種營養(yǎng)物質(zhì)及離子的跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運提供能量。細(xì)菌氫ATP酶的重要性在于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH水平，是細(xì)菌細(xì)胞生存和存活的必要條件?；贏TP，在排除其它，包括鈣（EGTA處理）、鈉鉀（烏本苷；ouabain處理）等ATP酶的干擾下，受到氫ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析氫ATP酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI裂解液（Reagent A）                                   毫升    
YIJI保存液（Reagent B）                                     毫升
YIJI緩沖液（Reagent C）                                  毫升
YIJI酶促液（Reagent D）                                   微升
YIJI反應(yīng)液（Reagent E）                                   毫升
YIJI底物液（Reagent F）                                      毫升
YIJI陰性液（Reagent G）                                       毫升
產(chǎn)品說明書                                                    1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；YIJI底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
恒溫?fù)u床：用于細(xì)菌培養(yǎng)
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
比色皿：用于光譜分析的容器
分光光度儀：用于光譜分析

實驗步驟
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI底物液（Reagent F）注意避光。然后進行下列操作。
 
一、樣品準(zhǔn)備

1．準(zhǔn)備好10毫升待測的細(xì)菌放進37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
2．直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 107細(xì)胞/毫升
3．置于冰槽里5分鐘
4．放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
5．小心抽去上清液
6．加入xx微升YIJI裂解液（Reagent A），充分混勻
7．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
8．強力渦旋震蕩15秒
9．置于冰槽里30分鐘，期間強力渦旋震蕩15秒三次
10．放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如eppendorf 5415）
11．小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
12．放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13．小心去掉上清液 
14．加入xx微升YIJI保存液（Reagent B），混勻
15．移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
16．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準(zhǔn)備

1．準(zhǔn)備好待測樣品（例如純化細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白等），置于冰槽里 
2．設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零
3．YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對照測定

1．移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
3．加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
4．加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
5．放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6．加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）
7．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8．即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘

四、樣品活性測定

1．移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
3．加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
4．加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
5．放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
6．加入50微升待測樣品（注意：50微克膜蛋白；樣品須溶解）
7．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8．即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘
 
五、計算樣品活性
 

注意事項

1．本產(chǎn)品為21次操作，包括背景對照測定
2．操作時，須戴手套
3．系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
4．建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  
5．加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測定
6．反應(yīng)測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)30分鐘
7．測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數(shù)高于10分鐘或30分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
8．光譜測定后，比色皿須清洗*
9．建議待測樣本膜蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒YJ30030.1）
10．樣品特異活性是指排除其它，包括鈣（EGTA處理）、鈉鉀（烏本苷；ouabain處理）等ATP酶的干擾后的氫ATP酶活性
11．氫ATP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
12．本公司提供系列ATP酶類分析技術(shù)產(chǎn)品 
 
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確

訂購信息

單組分訂購信息

編號                    名稱                                                規(guī)格        
YJ50244.3            YIJI細(xì)菌氫ATP酶活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒    20次        
YJ50244.3A            YIJI裂解液（Reagent A）                          100毫升
YJ50244.3B            YIJI保存液（Reagent B）                            50毫升
YJ50244.3C            YIJI緩沖液（Reagent C）                               100毫升
YJ50244.3D             YIJI酶促液（Reagent D）                                10毫升
YJ50244.3E             YIJI反應(yīng)液（Reagent E）                                10毫升
YJ50244.3F             YIJI底物液（Reagent F）                                10毫升
YJ50244.3G            YIJI陰性液（Reagent G）                            10毫升
YJ30030.1            YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒                    200次

試劑盒訂購信息

產(chǎn)品編號    名稱    規(guī)格
YJ50244.1    動物細(xì)胞氫ATP酶（H＋－ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒    20次
YJ50244.2    動物組織氫ATP酶（H＋－ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒    20次
YJ50244.3    細(xì)菌氫ATP酶（H＋－ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒    20次
YJ50244.4    酵母氫ATP酶（H＋－ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒    20次
YJ50241.5    植物氫ATP酶（H＋－ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒    20次