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上海源葉生物科技有限公司
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感受態(tài)細胞的制備及溶液配制
2012-7-7 閱讀(1680)
1. 挑取適當菌株的 E.coli 單菌落接種于 2mlSOB 培養(yǎng)液中，37℃搖床過夜。
2. 取 0.5-1ml 過夜培養(yǎng)的菌液 轉(zhuǎn)種到 50ml SOB 中，18℃劇烈震蕩，直到 A600達到 0.6。
3. 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管中，4℃ 4,000rpm/min離心 10min。同時在冰浴 上配置 TB 溶液。
4. 棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養(yǎng)液被吸干。
5. 取 1ml 剛配的 TB 溶液打散菌體沉淀，再加入 15mlTB（1/3 體積的起始培養(yǎng) 液） ，冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min離心 10min。
6. 棄上清，沉淀重懸于 4mlTB（1/12.5 體積的起始培養(yǎng)液） ，冰浴10min。
7. 加入 280μl DMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴 10min。
8. 將菌液分裝于 EP 管中，- 80℃或液氮凍存。
9. 取兩管感受態(tài)細胞分別加入 1μl 無菌 ddH2O（陰性對照）和 1μl 純質(zhì)粒（陽性 對照）進行轉(zhuǎn)化（見后） ，以檢測感受態(tài)的質(zhì)量陰。性對照平板上應該無菌落 生長，陽性對照平板上菌落數(shù)目的多少顯示感受態(tài)效率的高低。
SOB 的配制： 蛋白胨 20g
酵母提取物 5g
NaCl 0.58g
KCl 0.186g
100×Mg++溶液 10ml
溶解并加水定容至 1L，121℃×20min 高壓蒸汽滅菌
100×Mg++溶液： MgCl2﹒6H2O
MgSO4﹒7H2O
溶解并加水定容至 100ml，121℃×20min 高壓蒸汽滅菌
TB 溶液的配制： 1M KCl 5ml
0.55MMnCl2 2ml
0.5M CaCl2 0.6ml
0.1MK-Pipes（pH 6.7） 2ml
ddH2O 10.4ml
Total 20ml
注：上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理
0.1M K -Pipes（pH=6.7）的配制：
稱取 3.02g Pipes粉末溶于 80mldd H2O 中，此時粉末不能*溶解，用 10N KOH 或 KOH 固體調(diào)節(jié) PH 值，只有當 PH 接近 6.7 時粉末才能*溶解，此時 當小心少量地加入 KOH 直至達到所需 PH 值。
