摘要

分析儀器對于評估產(chǎn)品質(zhì)量和生物藥產(chǎn)品開發(fā)過程控制至關(guān)重要，它在制藥行業(yè)中應(yīng)用于各種應(yīng)用，如與產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)的研究，如單克隆抗體中的糖基分析和細胞培養(yǎng)基中氨基酸和代謝物濃度。盡管液相質(zhì)譜（LC-MS）具有靈活應(yīng)用解決復(fù)雜問題的能力，但其實驗開發(fā)通常比其他分析方法耗時更多。最近，如908 Devices的REBEL等新型分析設(shè)備采用了操作簡化用戶友好的方法，以替代傳統(tǒng)勞動密集型LC-MS。REBEL是一種能夠快速定量氨基酸和其他重要代謝物，實現(xiàn)全面分析和高通量樣本測試的儀器，而我們的目的是比較這一代分析平臺（908 Devices的REBEL）與經(jīng)典LC-ToF MS方法，并評估數(shù)據(jù)質(zhì)量。

引言

生物制藥公司越來越關(guān)注培養(yǎng)基成分的理解和產(chǎn)品的質(zhì)量，為了提高生產(chǎn)效率，他們必須面對的是耗時的傳統(tǒng)方法。細胞系開發(fā)和優(yōu)化是過程策略的重要組成部分。傳統(tǒng)上，使用液相質(zhì)譜（LC-MS）進行培養(yǎng)基營養(yǎng)和代謝組學研究，這需要高度的技術(shù)專長，且耗時較長。然而，優(yōu)化實驗需要對生物反應(yīng)器參數(shù)的實時監(jiān)測、過程分析和產(chǎn)品質(zhì)量屬性的結(jié)果來支持。908 Devices的全自動培養(yǎng)基組分分析儀系統(tǒng)，即REBEL，作為一種新型分析儀器，因其快速分析和簡單操作而受到生物制藥行業(yè)的廣泛關(guān)注。

本文介紹REBEL替代傳統(tǒng)LC-MS方法，在生物反應(yīng)器培養(yǎng)基監(jiān)測方面的最新進展。REBEL進行培養(yǎng)基分析的主要優(yōu)勢包括無需衍生化即可分析、快速的分析時間和簡單的操作。然而，由于該儀器是市場新秀，其分析技術(shù)描述尚不充分。因此，我們采用Waters的非衍生化和正相色譜方法，使用BioAccord RDa飛行時間（ToF）LC-MS進行培養(yǎng)基分析的比較。我們的目標是展示REBEL和RDa培養(yǎng)基分析結(jié)果的可比性，并探討兩種分析儀器方法的成本效益。此外，我們將在實驗室中建立這兩種分析方法，以便在未來代謝研究中評估過程變化、補料策略及其對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，從而深化我們對關(guān)鍵過程參數(shù)及其對藥物產(chǎn)品質(zhì)量特性影響的理解。

結(jié)果與討論

圖1. 生物反應(yīng)器1（頂部）和2（底部）的68到227小時的氨基酸濃度趨勢，pH 設(shè)定在7.1。樣品由Waters BioAccord RDa LC-MS（藍色）和REBEL培養(yǎng)基分析儀（紅色）進行分析。

圖2. 生物反應(yīng)器3（頂部）和4（底部）的68到227小時的氨基酸濃度趨勢，pH設(shè)定在 7.3。樣品由Waters BioAccord RDa LC-MS（藍色）和REBEL培養(yǎng)基分析儀（紅色）進行分析。

表1：REBEL和LC-MS之間的比較，其中+代表所需的技術(shù)專業(yè)知識或需要的數(shù)量。

我們能夠成功地使用REBEL和BioAccord RDa LC-MS上的初步方法運行所有樣品，從而在UNIFI上創(chuàng)建一種處理方法，以在我們的RDa LC-質(zhì)譜分析中從標準校準曲線中識別、質(zhì)量確認和量化所有氨基酸。Rebel導(dǎo)出了所有氨基酸的計算濃度，并創(chuàng)建了手動數(shù)據(jù)透視表來說明左側(cè)顯示的結(jié)果。生物反應(yīng)器復(fù)制品1和2在pH 7.1設(shè)定值下運行，并在整個培養(yǎng)物中顯示出相似的氨基酸趨勢（圖1）。類似地，生物反應(yīng)器復(fù)制品3和4在pH 7.3設(shè)定值下運行時相互共享趨勢（圖2）。生物反應(yīng)器1-4的氨基酸趨勢以藍色表示用于BioAccord RDa LC-MS分析，以紅色表示用于REBEL分析。REBEL和RDa LC-MS數(shù)據(jù)顯示所有反應(yīng)器的氨基酸趨勢相當。對于樣品制備，與RDa LC-MS的1:500相比，REBEL方法的樣品稀釋比例為1:100，這表明RDa LC-MS的靈敏度至少是REBEL的五倍。然而，我們可以看到，RDa LC-MS中204和227小時氨基酸濃度的較晚時間點遠高于REBEL。這很可能是因為這些值是在標準曲線之外發(fā)現(xiàn)的，因此，外推濃度會導(dǎo)致計算誤差。REBEL只能分析33種分析物，包括22種氨基酸、5種維生素和6種生物胺，其中RDa是Tof LC-MS，可以分析這些和其他未知的分析物。表1列出了REBEL與傳統(tǒng)LC-MS的比較，其中REBEL易于使用，不需要太多時間或精力來操作，但犧牲了在其范圍之外進行分析的能力，并且相比于TOF質(zhì)譜靈敏度略低。傳統(tǒng)的LC-MS方法可以以更好的靈敏度進行專門優(yōu)化，但這需要更高水平的技術(shù)技能。REBEL為自動化分析提供了包羅萬象的試劑盒，但每個樣本的試劑盒分析成本遠高于LC-MS方法所需的材料?？傮w而言，REBEL在其分析范圍內(nèi)以更高的運行成本/表現(xiàn)相對較好，但其易用性和快速分析是推進實時過程優(yōu)化的主要優(yōu)勢。

材料與方法

我們從Sartorius的AMBR250生物反應(yīng)器（VRC01 CHO細胞培養(yǎng)）中采集每日樣本，進行了一次10天的批次實驗。重復(fù)的生物反應(yīng)器1和2的pH為7.1，生物反應(yīng)器3和4的pH為7.3，其余保持一致。樣本經(jīng)過處理和過濾，用于分析細胞培養(yǎng)基反應(yīng)液的游離氨基酸濃度。

REBEL的培養(yǎng)基分析試劑盒（908 Devices）提供了BGE溶液和稀釋液，還有預(yù)制好的標準品。樣品用稀釋液稀釋100倍。所有的濃度數(shù)據(jù)以.csv文件形式輸出。而BioAccord RDa（Waters）的LC-MS方法是基于Waters的應(yīng)用指南調(diào)整的，以適應(yīng)Accuilty Patrols作為LC系統(tǒng)的特定設(shè)置。氨基酸細胞培養(yǎng)標準品（Waters）根據(jù)說明書新鮮制備，每個氨基酸的6點校準曲線為5uM-0.5uM，除了2.5uM-0.25uM的胱氨酸。新鮮制備樣品，并用0.1%甲酸以1:500稀釋。用UNIFI（Waters）處理獲得的LC-MS數(shù)據(jù)，以創(chuàng)建標準曲線，識別和量化氨基酸濃度。所有樣品（REBEL和BioAccord RDa）均進行三次重復(fù)。

結(jié)論

我們的初步RDa LC-MS方法表明，REBEL細胞培養(yǎng)基分析儀收集的數(shù)據(jù)與CHO細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器具有可比性。目前，基于REBEL的實驗結(jié)果，我們正在優(yōu)化RDa LC-MS方法，使用8點校準曲線（范圍0.1-30uM），以捕捉所有氨基酸濃度。一旦使用最終確定的RDa LC-MS方法對所有樣本進行分析，將進行進一步的方法比較和統(tǒng)計分析。我們將評估零假設(shè)的方法，即用REBEL進行的測量與用RDa LC-MS進行的測量不同，然后尋找基于數(shù)據(jù)的證據(jù)，證明測量是相同的。如果數(shù)據(jù)支持否定零假設(shè)，那么我們可以得出結(jié)論，這些儀器在每次比較的代謝物測量中都具有同等的性能。未來的研究將進一步測試REBEL評估代謝對產(chǎn)品質(zhì)量影響的能力，例如溫度變化對代謝產(chǎn)物利用的影響及其對微生物反應(yīng)器中聚糖譜的影響。由于細胞代謝可以在代謝產(chǎn)物的利用和濃度方面產(chǎn)生共線性，我們將使用多變量數(shù)據(jù)分析（MVDA）來評估細胞代謝及其對聚糖譜的影響。REBEL的易用性和快速分析的優(yōu)勢允許更大的樣本通量，同時保留與傳統(tǒng)LC-MS方法相似的數(shù)據(jù)質(zhì)量，以快速推進我們對關(guān)鍵質(zhì)量屬性的影響的理解，從而提高關(guān)鍵工藝參數(shù)的理解。