雙熒光素酶報告基因構(gòu)建及檢測服務(wù)服務(wù)項目簡介

      報告基因是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中用于分析結(jié)構(gòu)基因旁側(cè)區(qū)域潛在的順式元件(如啟動子、增強子和沉默子等)和反式作用因子相互作用關(guān)系的一種重要工具，在解析基因時空表達調(diào)控的內(nèi)在規(guī)律中發(fā)揮著重要作用，它具有便捷、可靠、靈敏度高和適用于大規(guī)模檢測等優(yōu)點。

      生興生物提供報告基因檢測服務(wù)，采用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)活性。該系統(tǒng)的檢測原理是，熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)，然后可以通過熒光測定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光，熒光閃爍總數(shù)與樣品中存在熒光素酶的活性成正比。

雙熒光素酶報告基因構(gòu)建及檢測服務(wù)服務(wù)內(nèi)容

      把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在luciferase的上游或其他適當(dāng)?shù)牡胤?，?gòu)建成報告基因質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。熒光素酶催化luciferin發(fā)光的zui強發(fā)光波長為560 nm。

實驗步驟

1. 分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
2. 構(gòu)建含調(diào)控元件序列的熒光素梅報告基因載體。
3. 篩選陽性克隆，測序。
4. 擴增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照，提純備用。
5. 培養(yǎng)目的細胞，并接種于孔板中，使生長達到80%匯合度。
6. 將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞。
7. 提取蛋白并用于熒光素酶檢測。
8. 加入底物，測定熒光素酶的活性。
9. 計算相對熒光強度，并與空載對照比較。
10. 實驗報告。

應(yīng)用領(lǐng)域

1. 熒光素酶基因標(biāo)記基因
2. 熒光素酶基因標(biāo)記細胞
3. 熒光素酶基因標(biāo)記微生物
4. 活體生物體內(nèi)成像
5. 藥物篩選
6. 雙報告基因系統(tǒng)