基因敲除用T7E1 核酸內(nèi)切酶

基因敲除用T7E1 核酸內(nèi)切酶應(yīng)用  

   ■ 基因突變和SNP的檢測，可應(yīng)用于TALEN、CRISPR/CAS9形成的突變體檢測

   ■  識別錯配 DNA，分解四方向交叉 DNA 或分支 DNA

   ■ 檢測或切割異源二聚體 DNA 和切割 DNA

   ■ 隨機(jī)切割線性 DNA 進(jìn)行 shot-gun 克隆

概述  

   T7 核酸內(nèi)切酶 I 識別并切割不*配對 DNA、十字型結(jié)構(gòu) DNA、Holliday 結(jié)構(gòu)或交叉 DNA、異源雙鏈DNA 或者以更慢的速度切割或切刻雙鏈 DNA。該酶切割錯配堿基 5′ 端的*、第二或第三個磷酸二酯鍵。

來源  

   重組T7 核酸內(nèi)切酶 I (T7 endonuclease I, T7E1 )

反應(yīng)條件

   Buffer [50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）], 即同1X NEBuffer 2，37℃溫育。

質(zhì)保聲明  

   T7 核酸內(nèi)切酶 I 經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)控檢測，確保該產(chǎn)品具有zui高的活性和純度。請使用前務(wù)必仔細(xì)閱讀本手冊。

單位定義  

   1 單位指在50 μL反應(yīng)體系，37℃，1 小時將1 μg超螺旋十字型結(jié)構(gòu)的pUC（AT）質(zhì)粒酶切成 90% 以上的線性DNA所需要的酶量。

注意事項(xiàng)  

   T7 核酸內(nèi)切酶 I 是一種具有底物結(jié)構(gòu)選擇性的酶。該酶以不同的活性作用于不同的 DNA 底物。切割特定底物時，必須控制酶量和反應(yīng)時間。反應(yīng)溫度超過 42℃時，會增加非特異性核酸酶活性。避免反應(yīng)溫度超過55℃，會導(dǎo)致酶活性降低。

T7E1酶切法檢測突變體實(shí)驗(yàn)步驟  

   1、PCR擴(kuò)增目的片段：

   PCR擴(kuò)增出帶有突變位點(diǎn)(如TALEN or CRISPR/Cas9的target site) DNA片段，長度約500 bp，突變位點(diǎn)不位于PCR片段*，這樣將切割出兩條大小不同的帶；

   PCR反應(yīng)的具體體系及條件參考實(shí)際使用的PCR聚合酶使用說明。

   2、 突變體DNA與野生型DNA的PCR產(chǎn)物（無需純化處理）按如下體系混合于EP管中：

   3、加熱變性、退火復(fù)性處理：

   兩種方法處理，任選其一，如下：

   I、在1L的燒杯中加入500mL水，加熱使其沸騰后，將步驟2中的EP管置于浮板上放入沸水中，停止加熱，將燒杯置于室溫，待其自然冷卻至室溫即可（此過程大約需1至1.5小時）

   II、使用PCR儀進(jìn)行退火處理，設(shè)置程序如下

   95℃    5 min

   94℃    2 sec，-0.1℃/cycle, 200 times

   75℃    1 sec，-0.1℃/cycle, 600 times

   16℃    2 min

   4、T7E1酶切反應(yīng)：

   上述反應(yīng)體系分別加入0.5 μL T7E1酶，37℃反應(yīng)30 min后，立刻加2μL DNA Loading Buffer（客戶自備），混勻后65℃煮10 min，跑2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分析酶切結(jié)果。（放置時間過長可能會導(dǎo)致PCR產(chǎn)物全部降解）

 圖. 非配對內(nèi)切酶法-T7E1法檢測突變體的突變率。

 突變型帶：大約300+200 bp

 野生型帶：大約500 bp

 突變率=突變型帶/(野生型帶+突變型帶)（按照帶的灰度計算）

  陽性參照  

   陽性參照是一個堿基的點(diǎn)突變檢測。使用本試劑盒提供陽性參照引物的混合物：

   Control-GC-F ACACCTGATCAAGCCTGTTC

   Control-GC-R CGCCAAAGAATGATCTGCG

   分別以陽性DNA Control C 和Control G為模板，PCR擴(kuò)增出600bp的陽性DNA片段，點(diǎn)突變標(biāo)示如下：

   陽性參照可以分別單獨(dú)PCR擴(kuò)增后， PCR產(chǎn)物等量混合，或者混合DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行加熱變性、退火復(fù)性處理后，使用T7E1酶切，產(chǎn)生400bp+200bp兩個端片段。

使用限制  

   本試劑*用于科學(xué)研究。

儲存與安全  

   本品4℃運(yùn)輸，儲存于-20℃，有效期12個月。長期儲存請置于-80℃。

本品采用藍(lán)冰運(yùn)輸，藍(lán)冰在使用前在-80℃冷凍至少72小時。實(shí)驗(yàn)證明，使用上述方法運(yùn)輸，即使到貨時藍(lán)冰已經(jīng)融化，泡沫塑料盒中的溫度仍然能保持在4℃或4℃以下24小時。比較干冰運(yùn)輸?shù)漠a(chǎn)品，其活性和穩(wěn)定性無任何差異。產(chǎn)品純化整個過程都在4℃進(jìn)行，且其貯存液經(jīng)過優(yōu)化，對保持酶活的穩(wěn)定性起到重要作用。產(chǎn)品中含有50%甘油，可以使酶在-35℃下保持液態(tài)，若使用干冰運(yùn)輸，酶將被冷凍，發(fā)生反復(fù)凍融可能會導(dǎo)致酶活性下降。