蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印法檢定蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印法檢定蛋白質(zhì) 

    蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE后，膠片浸入轉(zhuǎn)印緩沖液，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印到硝化纖維紙（nitrocellulose） 上，先經(jīng)?素洗去SDS，并使蛋白質(zhì)回?原態(tài)抗原性，可使用抗體進(jìn)?免疫染色 （Towbin et al, 1979）。

儀器用具：電泳轉(zhuǎn)印槽 （Hoefer Transphor TE 52）：轉(zhuǎn)印槽 （可容納4 個(gè)轉(zhuǎn)印三明治）轉(zhuǎn)印三明治 （轉(zhuǎn)印夾、方形海綿墊2 片）轉(zhuǎn)印紙：早期使用硝化纖維紙，現(xiàn)在多用尼龍材質(zhì)者Immobilon P （Millipore IPUH 000 10, 0.45 μm, PVDF 材質(zhì)）濾紙 （Whatman #1, 3MM） 兩張，裁成比轉(zhuǎn)印紙稍大者。供電器 （可供400~500 mA者）方形培養(yǎng)皿 （轉(zhuǎn)印紙清洗用）旋轉(zhuǎn)搖蕩器 （rotary shaker）

    藥品試劑：

    轉(zhuǎn)印緩沖液 （Blotting buffer）：10×溶液

    Tris （Tris base, 25 mM×10） 60.6 gm

    甘胺酸 （0.192 M×10） 288 gm加水1,500 mL 溶的，pH 以HCl 調(diào)到8.3，加水至 2,000 mL 使用時(shí)取500 mL 倒入一5 L 桶中，加500 mL 甲醇后，加水到5 L，均勻攪拌的。 如此配成者，含10%甲醇；?是轉(zhuǎn)印勝或是蛋白質(zhì)的分子?太小，可提高到20%。

    甲醇 （用?潤(rùn)濕尼龍材質(zhì)的轉(zhuǎn)印紙）

    PBST 洗液：PBST 為pH 7.0 的PBS （phosphate buffered saline） 緩沖液，另加有0.05%Tween-20，用?清洗轉(zhuǎn)印紙，以去除非專(zhuān)一性的蛋白質(zhì)吸附。

    ?素洗液 （6M Urea-PBST） :?素180 gm 溶在300 mL PBST 中，加溫?cái)嚢枞芙?，再?/span>PBST 至500 mL。

    方法步驟：

    ◆ 全程請(qǐng)戴手套操作，以免污染轉(zhuǎn)印紙！

    1） 電泳后SDS-PAGE 膠片浸在轉(zhuǎn)印緩沖液中，洗2~3 次，每次10 min。

    2） 取出轉(zhuǎn)印槽，先小心放一攪拌子在底部，再倒一半轉(zhuǎn)印緩沖液。

    ◆ 攪拌子千萬(wàn)?能丟到轉(zhuǎn)印槽內(nèi)，會(huì)打破轉(zhuǎn)印槽底部的陶瓷散熱片。

    3） 取轉(zhuǎn)印紙切成約如膠片大小，先在方形培養(yǎng)皿中以少許甲醇浸濕數(shù)秒鐘，再置入轉(zhuǎn)印槽中的緩沖液10 min 后使用。 另取兩張濾紙，以及兩片方形海綿墊，?放在轉(zhuǎn)印槽的緩沖液中備用。

    4） 取出轉(zhuǎn)印夾打開(kāi)平放，先墊一張方形海棉墊，鋪上一張濕濾紙，小心迭上已潤(rùn)濕的轉(zhuǎn)印紙，其間勿陷入氣泡；轉(zhuǎn)印紙?jiān)俚紊蠑?shù)滴緩沖液后，小心平鋪膠片上去，加蓋一層濾紙，及另一張海綿，也??可陷入氣泡，即可把整個(gè)轉(zhuǎn)印三明治卡夾裝好。

    ◆ 膠片迭到轉(zhuǎn)印紙時(shí)，一次成功，?要重作，否則蛋白質(zhì)色帶可能會(huì)印上去，zui后產(chǎn)生重迭影像。

    5） 將轉(zhuǎn)印三明治置入已經(jīng)放有一半轉(zhuǎn)印緩沖液的轉(zhuǎn)印槽中，注意有轉(zhuǎn)印紙的那一面向正極 （紅色），膠片那面向負(fù)極 （黑色）。

    6） 當(dāng)三明治?放入轉(zhuǎn)印槽后，以轉(zhuǎn)印緩沖液蓋滿(mǎn)所有的三明治，小心動(dòng)一動(dòng)卡夾，除去附在卡夾內(nèi)外的氣泡，蓋上蓋子，放到一攪拌器上，打開(kāi)攪拌器開(kāi)始攪拌，同時(shí)接好電源，裝置完成后放置10 min。

    7） 以400 mA 開(kāi)始轉(zhuǎn)印，溫?會(huì)漸漸上升，轉(zhuǎn)印1.5 h 后中止轉(zhuǎn)印，取出轉(zhuǎn)印三明治，打開(kāi)后依次取出轉(zhuǎn)印紙及膠片。

    ◆ 上述轉(zhuǎn)印條件會(huì)使溫?上升至70~90℃，?有?卻系統(tǒng)，可把溫?控制設(shè)在5℃；轉(zhuǎn)印槽內(nèi)應(yīng)該加以攪拌，以?使整個(gè)溫?分布均勻。

    8） 轉(zhuǎn)印后的膠片可以繼續(xù)進(jìn)?CBR 染色，看有無(wú)蛋白質(zhì)殘?。 ?電泳時(shí)加有藍(lán)色標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker （SeeBlue），則可在轉(zhuǎn)印紙上看到藍(lán)色的色帶，確定轉(zhuǎn)印成功，并可評(píng)估轉(zhuǎn)印效?。

    9） 轉(zhuǎn)印紙浸在約15 mL ?素洗液中浸洗過(guò)夜，期間換三次?素洗液，并且要溫和搖蕩的。

    10） ??做免疫染色，則轉(zhuǎn)印后?用?素洗液清洗，以清水沖過(guò)后改用amido black （l %溶于10%甲酸） 染色1 h，再以10%甲酸脫色，沖水后晾干即可，但其?敏?較低。