超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒說明書微量法

超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒說明書微量法

注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃避光保存；

試劑二：粉劑 ×1 支，4℃避光保存；臨用前使用20ml試劑一充分溶解，配好的試劑4℃避光可保存一周。

試劑三：液體 110μL×1 支，4℃保存；臨用前將試劑三用蒸餾水稀釋10 倍，用多少配多少。試劑四：液體 2.5mL×1 瓶，-20℃保存。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾

水

產(chǎn)品說明：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是 H2O2 主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。

通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-.)，O2-.可與 WST-8 反應(yīng)產(chǎn)生水溶性染料甲臜，后者在 450nm 處有吸收；SOD 可清除 O2-.，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液黃色越深，說明SOD 活性愈低，反之活性越高。

操作步驟：

一、樣品的前處理：

(1)細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照每 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液（生理鹽水或者PBS），超聲波破碎（功率 20%或 200w，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）。8000g 4℃離心 10 分鐘，取上清， 置冰上待測(cè)。

稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液（生理鹽水或者PBS）進(jìn)行冰浴勻漿； 8000g 4℃離心 10 分鐘，取上清，置冰上待測(cè)。

(2)血清(漿)樣品：直接檢測(cè)二、測(cè)定操作表：

1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm，蒸餾水調(diào)零。

2.測(cè)定前將試劑一、二和四 37℃水浴 5min 以上。

3.樣本測(cè)定（按順序加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置 30min 后，450nm 處測(cè)定各管吸光值 A。

注意事項(xiàng)：

1、試劑三為酶，不可冷凍，使用時(shí)在冰上放置。

2、對(duì)照管只需要做三管，求平均值。

3、SOD 為什么有的樣本測(cè)定管大于對(duì)照管，對(duì)照管數(shù)值在什么范圍？對(duì)照管的范圍是 0.4-1。對(duì)照管吸光值過低可能是：

（1）試劑三活性低，可以適當(dāng)減少稀釋倍數(shù)；

（2）沒有按順序加試劑；

（3）反應(yīng)時(shí)間不夠，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間可以延長(zhǎng)到 40min）。

（4）對(duì)照管吸光值過高可能是試劑三未按操作說明書稀釋相應(yīng)倍數(shù)。

（5）可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大，為了降低雜質(zhì)的影響一般，將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10 倍后再測(cè)，通?？梢允箿y(cè)定正常。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

SOD 活性計(jì)算：

1、抑制百分率的計(jì)算

抑制百分率＝(A 對(duì)照管－A 測(cè)定管) ÷A 對(duì)照管× 100%

盡量使樣本的抑制百分率在 10-90%范圍內(nèi)。如果計(jì)算出來的抑制百分率小于 10%或大于90%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測(cè)定。如果測(cè)定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用提取液適當(dāng)稀釋；如果測(cè)定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測(cè)樣本。

2、SOD 酶活性單位：在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為 50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD

酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。

3、SOD 酶活性計(jì)算：

血清（漿）SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1 －抑制百分率)×V 反總]÷V 樣

=20×抑制百分率÷(1 －抑制百分率) 組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞SOD 活力計(jì)算：

按樣本蛋白濃度計(jì)算

SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1 －抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr )

=20×抑制百分率÷(1 －抑制百分率)÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用上海研謹(jǐn)生物科技有限公司BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。按樣本鮮重計(jì)算

SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1 －抑制百分率)×V 反總]÷(W ×V 樣÷V 樣總)

=20×抑制百分率÷(1 －抑制百分率)÷W c.按細(xì)菌或細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算

SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1 －抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)

=0.04×抑制百分率÷(1 －抑制百分率)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；

V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；

V 樣總： 加入提取液體積，1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL ；

W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

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