一、實驗原理

         限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。其中Ⅱ類酶在分子克隆和基因操作中zui為有用，是常用的分子生物學工具酶。         

限制性內(nèi)切酶識別序列長度一般為4～8個呈回文序列的特異核苷酸對。一般情況下，識別序列越長，在同一DNA分子中識別位點出現(xiàn)的頻率就越小。許多限制性內(nèi)切酶的酶切位點已被確定。例如EcoRl 酶的識別與切割序列為以下6個堿基對。

                                 5′……GAATTC……3′

                                3′……CTT AAG…… 5′ 

 EcoR I以*的方式識別并裂解這個順序，形成兩個5′突出末端：

和
 
            ……G                              AATTC……

                          ……CTT AA                            G……

這些末端為互補的，即粘性末端，并可在連接酶的催化下與由EcoR I產(chǎn)生的其它分子末端相連接。

限制性內(nèi)切酶主要用于基因組DNA的片段化、重組DNA分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的基因片段的分離與回收以及DNA分子物理圖譜的構(gòu)建等。根據(jù)酶切目的和要求不同，可有單酶切、雙酶切或部分酶切等不同方式。根據(jù)酶切反應的體積不同，可分為小量酶切反應和大量的酶切反應。小量酶切反應主要應用于質(zhì)粒的酶切鑒定，體積為20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反應用于制備目的基因片段，體積為50～100 μl，DNA用量在10～30ug。

本實驗為EcoR I對質(zhì)粒pUC18的小量酶切。  在質(zhì)粒的雙鏈環(huán)狀DNA分子上有多個限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點。在用特定的限制性內(nèi)切核酸酶對質(zhì)粒進行酶切反應后，通?？刹捎铆傊悄z電泳進行鑒定酶切效果。

     二、儀器與試劑

1.儀器：

        水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、 電泳設備等。

        2.試劑：

質(zhì)粒pUC18、EcoR I限制性內(nèi)切核酸酶、內(nèi)切酶反應緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、6×上樣緩沖液、溴化乙啶染液、無菌水等。

    三、操作步驟

1．限制性內(nèi)切酶反應一般在滅菌的0.2或0.5ml PCR薄壁離心管中進行。

2. 酶切反應體系（10ul）：

酶解緩沖液（10×buffer）    1 ul

  限制性內(nèi)切酶                          0.5 ul EcoR I（7.5U）     

底物DNA（質(zhì)粒）                 x ul（依質(zhì)粒濃度而定）

滅菌ddH2O                              加至10 ul

           限制性內(nèi)切酶zui后加入，手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸，混勻后6000 r/min，離心15s。37℃水浴消化2h。

        3.酶切完畢，取5ul酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定酶切反應效果，必須用DNA分子量標準物同時進行電泳以確定DNA的片段的大小。如果酶切不*，可繼續(xù).酶解消化反應，或加入適量酶后繼續(xù)反應。

5. 經(jīng)電泳觀察酶切反應*后，將上述反應液置65℃水浴中10～15min，中止酶切反應，將剩余酶切產(chǎn)物保存于?C20℃?zhèn)溆谩?br />
    四、注意事項

    1.限制性內(nèi)切酶需保存于-20℃，操作時應將酶保持在冰浴中，避免長時間置于高溫中。

       2. 限制性內(nèi)切酶溶液通常含有50%甘油，加入反應管后，因密度較大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分搖勻。

      3. 加樣時吸頭垂直進入試劑管，避免碰到管壁，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。

      4. 酶（置于冰盒上）應zui后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深。

       5. 酶解消化反應溫度及時間根據(jù)該酶使用說明書而定。

        6. 注意酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA計算，酶的體積應低于反應總體積的10%，以避免酶液中甘油干擾反應  。酶量過大（≥25U/ug DNA）時，有產(chǎn)生所謂星號活性的可能，即在識別序列以外的位點進行切割。此外，反應體系中甘油的質(zhì)量分數(shù)大于12%，以及缺少NACL和存在M等情況下，都有可能出現(xiàn)星號活性。

           五、相關(guān)問題

    1.酶的保存

         不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中，這種特定配方的緩沖液能使酶活性維持較長時間。常用的保存緩沖液各組分作用如下：

            Tris-HCl  （7.4―7.8）：          維持穩(wěn)定的pH范圍。

           50-100mmol/L   NaCl或KCl：提供一定的離子強度。

           0.1mmol/L  EDTA：                   絡合掉能激活限制酶的鎂離子。

            1mmol/L   DTT：                        保護酶分子上的還原性基團。

           200-500ug/ml BSA：                   牛血清白蛋白提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，防止蛋白質(zhì)分子濃度過低而導致酶分子變性。

            50%的甘油：                             使酶液保存于-20℃不至凍結(jié)。

        1-5 g/L的Triton-100：                這是一種非離子型表面活性劑，能防止蛋白質(zhì)分子的表面變性作用。

         2. 酶單位的定義

         限制酶的單位通常定義為：1U的酶能在約50ul合適的反應緩沖體系中，在1h內(nèi)完成酶切1ug的λDNA。確定限制酶單位的具體操作方法是分別向1ug的底物中加入一系列的酶（1U左右），當電泳觀察到酶切片段的條帶不再發(fā)生變化時說明已作用*，*切割的zui少酶量定為1U的酶量。

        3. 限制酶的作用條件

         限制酶切割DNA的反應中，酶切條件是實驗成功的重要因素，其中包括反應的溫度、時間與反應的緩沖體系，除了這些條件外，DNA的純度與濃度也會影響酶切效果，只有在正確選擇酶反應條件時才能達到*酶切效果。

       （1）作用溫度

         早期的酶切反應都在37℃進行，這種方法雖然簡單、統(tǒng)一，但卻不能達到每個酶的zui適反應溫度。為了達到*酶切的效果，根據(jù)所選用的酶確定所需要的反應溫度。

       （2）緩沖體系

          限制酶反應的緩沖體系大致相同，都含有以下組分：約100mmol/L的Tris-HCl，作用是將酶反應體系的pH維持在7.5-8.5；約10mmol/L的MgCl2，作用是為限制酶提供激活因子；1mmol/L的DTT，作用是保護還原性基團；約150mmol/L的NaCl，作用是提供合適的離子強度。由于認識的局限性，早期的限制酶反應體系僅根據(jù)其中NaCl含量的不同分為高鹽、中鹽與低鹽三種，這同樣不能使每種酶獲得zui適反應條件?，F(xiàn)在提供酶的很多廠商能提供4-10種緩沖體系，其中各必需成分之間只有很小的差別，目的是使每種酶都發(fā)揮zui大的作用。

緩沖液一般配成10倍的濃度，使用時以1/10的比例加入，當然為了減小吸量誤差也可自行配制5倍的緩沖液。

        （3） 反應體積與時間

         酶反應體積一般不宜小于20ul。因為過小的反應體積在加入各種成分時易產(chǎn)生誤差，甘油含量易超過10%。在37℃保溫可因水分蒸發(fā)而明顯改變反應體系中各成分的濃度，從而影響酶活力。同時還要考慮反應完畢進行電泳時，所加樣品中DNA的量能夠在電泳中顯出清晰的泳帶。

         常規(guī)的酶切反應一般控制在60min內(nèi)進行，但也可以根據(jù)切割對象與所用的酶將保溫時間延長至十幾個小時。

        （4） DNA的純度與濃度

         除了上述酶反應條件外，影響酶切效果的zui主要因素是DNA的純度。例如，樣品中含有大量RNA雜質(zhì)時會因減少了酶的有效濃度而影響酶切效果；某些雜蛋白未除凈而結(jié)合在DNA時也會影響酶切效果。。至于抽提過程中未除凈的各種影響因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是瓊脂糖凝膠中的硫酸根離子等。

         DNA純度的另一個指標是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后電泳結(jié)果顯示出不清晰條帶或成為一片紅色（術(shù)語稱Smear）時，可肯定系統(tǒng)中已經(jīng)污染了DNA酶。

DNA樣品中含有大量RNA時可用RNA酶處理；含有結(jié)合在DNA上的雜蛋白與DNA酶時都可用氯仿/異戊醇抽提；當樣品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物質(zhì)時可以通過沉淀更換一個新的緩沖體系。當然，酶切失敗時也不能排除除DNA外的一切因素，如無菌水，EP管，吸咀等的干凈程度以及內(nèi)切酶自身的酶活性情況。

除純度外，DNA的濃度也會影響酶切效果，一般DNA質(zhì)量濃度在1ug/20ul才能得到較好的酶切效果，質(zhì)量濃度高達1.5ug/20ul時就可能發(fā)生酶切困難。

        （5）終止酶切反應的方法

如果需對酶切片段進行連接或標記等操作時，首先要將限制酶滅活。滅活的方法可分為三種：*種是向反應緩沖體系中加入終濃度為10-12.5mmol/L的EDTA，原理是絡合掉酶反應中所需的鎂離子。但這種方法會影響需鎂離子的后續(xù)反應。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法來更換緩沖體系，以除去EDTA，但這樣就會造成DNA的損失。第二種方法是熱失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保溫60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保溫30min方能達到目的；的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加熱的方法使之失活。熱失活方法的特點是簡單并且未向體系中引入任何物質(zhì)，特別適用于連續(xù)進行幾個酶切反應；熱失活法的另一個特點是不用更換體系，所以不會造成DNA的損失。第三種方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA的片段。這種方法的特點是處理條件劇烈，能使酶*失活（不像*種方法中酶蛋白并未變性而只是沒有激活因子而已）。